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Title: Identificação e caracterização funcional de atividade apirásica nas salivas de triatomíneos vetores da Doença de Chagas
Authors: Pires, Danielle Lacerda
Orientador(es):: Santana, Jaime Martins de
Assunto:: Chagas, Doença de
Patologia molecular
Issue Date: 19-Jan-2011
Citation: PIRES, Danielle Lacerda. Identificação e caracterização funcional de atividade apirásica nas salivas de triatomíneos vetores da Doença de Chagas. 2006. 77 f. Dissertação (Mestrado em Patologia Molecular)-Universidade de Brasília, Brasília, 2006.
Abstract: Os artrópodes hematófagos são capazes de neutralizar defesas do hospedeiro durante repasto, devido à presença de ampla variedade de fatores anti-hemostáticos presentes em suas salivas como vasodilatadores, fatores antiplaquetários e anticoagulantes. O principal mecanismo de transmissão da Doença de Chagas é a contaminação do hospedeiro por excretas de triatomíneos infectados. O Triatoma infestans Klug, 1834, o principal vetor do mal de Chagas no Brasil, possui várias apirases em sua saliva que inibem a agregação plaquetária do hospedeiro. Neste estudo, nós mostramos que as apirases de 88, 82 e 79 kDa desse inseto são antigenicamente distintas e localizam-se na unidade D2 de sua glândula salivar. O conteúdo de uma unidade D2, e não os das outras, foi capaz de inibir a agregação de plaquetas, induzida por ADP, presentes em 1 mL de sangue. Em adição, identificamos pela primeira vez atividades apirásicas nos conteúdos de glândulas salivares de Rhodnius brethesi Matta, 1919; Rhodnius milesi Carcavallo, Rocha, Galvão, Jurberg & Valente 2001; Rhodnius pictipes Stal, 1872 e Rhodnius robustus Larrousse, 1927 por meio de testes enzimáticos utilizando ATP e ADP como substratos. Os ensaios enzimáticos, realizados a 37 °C e pH 8,3, revelaram que as atividades apirásicas são dependentes de cálcio. As atividades apirásicas das glândulas salivares de R. brethesi e R. pictipes foram parcialmente purificadas em coluna de Oligo dT Celulose. Para identificação de proteínas relacionadas com essa atividade, extratos glandulares e frações eluídas da coluna de Oligo dT, não fervidos e não reduzidos, foram submetidos à enzimografia após separação em SDS-PAGE. Este experimento revelou bandas de proteínas com atividades ATPásicas e ADPásicas de aproximadamente 44-45 kDa. Adicionalmente, experimentos de agregação plaquetária realizados in vitro demonstraram que 0,5 par de glândula salivar de R. brethesi, R. milesi, R. pictipes e R. robustus inibiram totalmente a agregação plaquetária induzida por ADP. Diferentemente das apirases de T. infestans, as de Rhodnius spp. são de baixa massa molecular e não fazem parte da família das 5´nucleotidases. A ampla distribuição das apirases nas salivas dos vetores da doença de Chagas e de outros artrópodes indica que estas enzimas têm importância fundamental na hematofagia.
Abstract: Blood-feeding arthropods are able to constraints barriers imposed by host defenses, due to the presence of a wide range of antihemostatic factors in their saliva, including vasodilators, antiplatelet factors and anticoagulant. The main Chagas disease transmission mechanism is contamination of a host by faeces from triatominae infected. Triatoma infestans Klug, 1834, the main vector of Chagas disease in Brazil, expresses several apyrases in its saliva that inhibit the vertebrate host platelet aggregation. We show in this report that the 88, 82 E 79 kDa apyrases of the insect are antigenically different and localize within the salivary gland D2 unit. The content of one D2 unit, and not that of the others, was able to mediate fully inhibition of platelet aggregation induced by ADP, from 1 mL of human blood. In addition, we identified for the first time apyrase activities in the saliva of Rhodnius brethesi Matta, 1919; Rhodnius milesi Carcavallo, Rocha, Galvão, Jurberg & Valente 2001; Rhodnius pictipes Stal, 1872 e Rhodnius robustus Larrousse, 1927. The tests, which were accomplished at 37 °C and pH 8,3, revealed that these apyrase activities are dependent upon Ca+2 . The apyrase activities present in the salivary glands of R. brethesi e R. pictipes were then partially purified on an Oligo dT Cellulose® column. To identify proteins related to apyrase activity, salivary gland content and eluted fractions from the Oligo dT column were submitted to SDS-PAGE enzimography without previous boiling or reduction of the samples. This experiment allowed the identification of 44-45 kDa protein bands displaying both ATPase and ADPase activities. In vitro platelet aggregation assays showed that the content of 0,5 salivary gland pair R. brethesi, R. milesi, R. pictipes e R. robustus completely abolished platelets aggregation induced by ADP. Differently fromf T. infestans apirases, Rhodnius spp. express apyrases of low molecular masses that aren’t members of the 5´nucleotidase family. The wide distribution of apyrases in the saliva of Chagas disease vectors and other arthropods indicate that these enzymes play an important role during the hematophagous process.
Description: Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Faculdade de Medicina, 2006.
metadata.dc.description2: Dissertação apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Patologia Molecular da Universidade de Brasília como requisito parcial à obtenção do grau de Mestre em Patologia Molecular.
Appears in Collections:FMD - Mestrado em Patologia Molecular (Dissertações)

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