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Please use this identifier to cite or link to this item: http://repositorio.unb.br/handle/10482/5790
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Title: Clonagem e caracterização do fator inibitório de macrófago do fungo Paracoccidioides brasiliensis
Authors: Oliveira, Gina Camilo de
Orientador(es):: Brígido, Marcelo de Macedo
Maranhão, Andréa Queiroz
Assunto:: Genética molecular
Fungos
Biologia molecular
Issue Date: 27-Oct-2010
Citation: OLIVEIRA, Gina Camilo de. Clonagem e caracterização do fator inibitório de macrófago do fungo Paracoccidioides brasiliensis. 2006. 98 f. Dissertação (Mestrado em Patologia Molecular)-Universidade de Brasília, Brasília, 2006.
Abstract: O fungo dimórfico Paracoccidioides brasiliensis é o agente etiológico da paracoccidioidomicose (PCM), uma micose sistêmica e endêmica na América Latina. Estima-se que 10 milhões de indivíduos estejam infectados, mas apenas 2% desenvolvem a doença. A forma miceliana encontrada na natureza constitui a fase infectiva que diferencia para a forma de levedura no pulmão humano estabelecendo a infecção. O fungo promove uma resposta imunitária mediada por células e uma resposta inflamatória no pulmão. Os macrófagos são células efetoras do sistema imunitário que reconhecem e eliminam patógenos invasores. Inicialmente identificada como uma citocina de linfócitos T, o fator inibitório de macrófago (MIF) é também uma citocina do macrófago e atua como um importante mediador da inflamação, devido às suas características imunomodulatórias. MIF apresenta atividade enzimática de tautomerase, conferida pelo aminoácido Prolina conservado na posição 2 e também tem uma participação importante no ciclo celular por meio da inibição da apoptose ao inativar p53. O Projeto Genoma Funcional e Diferencial de P. brasiliensis realizado no Laboratório de Biologia Molecular da Universidade de Brasília junto à Rede Genoma Centro-Oeste permitiu a geração de ESTs (do inglês “Expressed Sequence Tags”) a partir de bibliotecas de cDNA das formas de micélio e levedura de P. brasiliensis. Não há relatos na literatura de homólogos de MIF em fungos, porém, no genoma do P. brasiliensis foi descrito uma seqüência que possui similaridade gênica significativa com o MIF de mamíferos, indicando um envolvimento potencial na patogênese do P .brasiliensis. O fragmento encontrado (contig 1528: pbmif) é de aproximadamente 400 pares de bases, diferencialmente expresso na fase de levedura de P.brasiliensis. MIF é uma proteína que possui homólogos em plantas, nematóides e vertebrados. O objetivo desse trabalho é identificar e caracterizar possíveis clones de cDNA (PbMIF) homólogos a MIF isolado da biblioteca de P. brasiliensis. Um clone de cDNA de MIF foi seqüenciado e identificado como similar a MIF humano. A expressão do mRNA é diferencial em levedura, como detectado por Northern Blot. A sequência de aminoácidos de MIF do P. brasiliensis tem similaridade de 56% (32% de identidade) com o MIF de Mus musculus. Para a produção da proteína recombinante em Escherichia coli, o cDNA de MIF foi clonado no vetor de expressão (pET21). A detecção e caracterização de um homólogo de fator inibitório de macrófago (MIF) no P. brasiliensis é um relato inédito descrito em fungos e o papel de MIF mimetizando uma citocina pode revelar novos fatores de virulência para a infecção pelo P. brasiliensis. Portanto, pela coevolução com o sistema imunitário, patógenos poderiam desenvolver relevantes estratégias para evasão das defesas do hospedeiro desenvolvendo moléculas homólogas a citocinas, como seria o caso do MIF de P. brasiliensis. O papel do MIF de P.brasiliensis é desconhecido, assim sua caracterização favorecerá o desenvolvimento de informações sobre o mecanismo de patogenicidade do fungo . _________________________________________________________________________________ ABSTRACT
The dimorphic fungus Paracoccidioides brasiliensis is the etiological agent of paracoccidioidomycosis (PCM), a fungal disease that is endemic in Latin America. This infection affects 10 million individuals but only 2% develop the disease. The mycelia found in nature constitute the infective phase that differentiates to yeast form in the human lungs to establish the infection. The fungus promotes a cell mediated immune and inflammatory pulmonary response. Macrophages are pivotal effector cells of the innate immune system, recognizing and eliminating invasive microbial pathogens. Initially identified as a T-cell cytokine, the Macrophage Migration Inhibitory Factor (MIF) is also a macrophage cytokine and an important mediator of inflammation, it has immunomodulatory characteristics. MIF has enzymatic activity relationed to the Nterminal proline residue in the position 2 and MIF can inhibit apoptosis through the inactivity of p53. From the project “Functional and Differential Genome of P. brasiliensis” ESTs (Expressed Sequence tags) database we discover a putative fungi homologue to the mammalian MIF. There are no previous reports in the literature of MIF homologues in fungi, however the sequence described in the genome of P. brasiliensis has sequence similarity to MIF genes found in animal, nematode and plant. The aim of this work is to investigate the gene encoded by the Pb MIF homolog in order to characterize its coding sequence and predicted polypeptide and characterize the differential expression. A MIF related cDNA clone was fully sequenced and the predicted MIF homolog was identified. The mRNA expression is restricted to the yeast form, as detected by Northern Blot. Sequence analysis indicated that the predicted amino acid sequence has a similarity of 56% (32% identical) with the MIF of Mus musculus. The Pb MIF CDS (coding sequence) was subcloned into bacterial expression vector (pET21) fused to a histidine tag. This CDS was expressed in Escherichia coli to produce recombinant protein. We have detected and characterized a Pb MIF putative homolog. This is the first report of a MIF homolog among fungi and its role as a cytokine mimetic may reveal new virulent factors for P. brasiliensis infection. During the co-evolution with immune system, pathogens must had developed relevant strategies of evasion of host response. Though incorporating cytokines homologs may be a successful strategy for P. brasiliensis infection. The Pb MIF homolog may be part of an unknown strategy for P. brasiliensis survival inside the mammalian host.
Description: Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Faculdade de Medicina, 2006.
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