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Please use this identifier to cite or link to this item: http://repositorio.unb.br/handle/10482/5253
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Title: Análise proteômica de Trypanosoma cruzi : construção de mapas bidimensionais em pH alcalino
Authors: Magalhães, Adriana Dias
Orientador(es):: Ricart, Carlos André Ornelas
Assunto:: Chagas, Doença de
Issue Date: 14-Jul-2010
Citation: MAGALHÃES, Adriana Dias. Análise proteômica de Trypanosoma cruzi: construção de mapas bidimensionais em pH alcalino. 2006. 54 f. Dissertação (Mestrado em Patologia Molecular)-Universidade de Brasília, Brasília, 2006.
Abstract: O Trypanosoma cruzi é o parasita causador da doença de Chagas, a qual atinge 16-18 milhões de pessoas. Recentemente, o seqüenciamento do genoma do T. cruzi foi concluído, o que deu novo impulso aos projetos pós-genômicos visando a elucidação da expressão diferencial de proteínas ao longo do ciclo de vida do parasita. A proteômica é bastante apropriada para este fim, já que a regulação da expressão de proteínas em T. cruzi ocorre em nível póstranscricional. Objetivando-se o estudo das proteínas básicas do proteoma de T. cruzi, condições para eletroforese bidimensional (2-DE) em pH alcalino das formas epimastigotas, tripomastigotas e amastigotas foram estabelecidas. Tornou-se necessário otimizar as condições experimentais para tais géis, já que nessa faixa de pH é normal o aparecimento de longas listras horizontais (streaking), baixa resolução de spots e baixa reprodutibilidade. O protocolo final, desenvolvido para formas epimastigotas, consistiu na adição de 10% de isopropanol ao tampão de reidratação do gel de gradiente imobilizado de pH, aplicação da amostra em uma fita de papel de filtro conectada ao anôdo, uso de fita embebida com solução de DTT junto ao catôdo e focalização isoelétrica utilizando-se o equipamento Multiphor II (GE Healthcare). Um total de 10 spots do gel de epimastigotas foram identificados por impressão digital do mapa peptídico (peptide mass fingerprint). As proteínas identificadas foram: fosfoglicerato quinase, prostaglandina F2a sintase, peptídeo metionina sulfóxido redutase, metiltioadenosina fosforilase, proteína dissulfeto isomerase, AKB ligase e quatro proteínas hipotéticas (hipotéticas). As condições padronizadas para a 2-DE foram aplicadas na construção de mapas bidimensionais das formas tripomastigotas e amastigotas. Os mapas resultantes permitiram verificar diferenças de expressão entre os proteomas. Por último, foi testada a metodologia do gel “dois em um” para 2-DE em faixa ampla de pH, que mostrou resultados promissores para futuras análises da expressão comparativa de proteínas em T.cruzi.
Abstract: Trypanosoma cruzi is the parasite that causes Chagas disease, a chronic illness that affects 16-18 million people. Recently, the sequencing of T. cruzi genome was concluded. This accomplishment stimulated post-genomic projects aiming at elucidating the differential protein expression through the parasite life cycle. Proteomics is the most suitable methodology for this since T. cruzi protein expression regulation occurs at post-transcriptional level. In order to study the basic proteins from T. cruzi proteome, conditions for two-dimensional gel electrophoresis (2-DE) of epimastigote, trypomastigote and amastigote life forms were developed. It was necessary to optimize the 2-DE experimental conditions since in the alkaline pH range the gels usually presents spot streaking, low resolution and poor reproducibility. The final protocol, developed for epimastigotas, consisted of the addition of 10% isopropanol to the IPG gel strip rehydration buffer, sample loading using the “paper bridge” method, use of paper strip embedded in DTT solution near the cathode and isoelectric focusing using the Multiphor II apparatus (GE Healthcare). A total of 10 spots from the epimastigote gel were identified by peptide mass fingerprinting. The identified proteins were phosphoglycerate kinase, prostaglandin F2a synthase, methionine peptide sulfoxide reductase, methylthioadenosin phosphorylase, protein disulfide isomerase, AKB ligase and four hypothetical proteins. The optimized 2-DE conditions were applied to the construction of trypomastigotes and amastigotas two dimensional maps. The resulting maps permitted the visualization of differences in protein expression among the proteomes. Finally, the “two-in-one” 2-DE methodology for wide range pHs was tested and gave promising results that may be used in future studies on T. cruzi comparative protein expression.
Description: Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Faculdade de Medicina, 2006.
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