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Please use this identifier to cite or link to this item: http://repositorio.unb.br/handle/10482/35376
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Title: Caracterização da atividade eletrofisiológica da toxina Ts17, isolada da peçonha do escorpião Tityus serrulatus, em canais de sódio dependentes de voltagem
Authors: Menezes, Luis Felipe Santos
Orientador(es):: Schwartz, Elisabeth Nogueira Ferroni
Assunto:: Escorpião
Escorpião - toxinas
Canais de sódio
Peçonha
Canais iônicos
Issue Date: 27-Aug-2019
Citation: MENEZES, Luis Felipe Santos. Caracterização da atividade eletrofisiológica da toxina Ts17, isolada da peçonha do escorpião Tityus serrulatus, em canais de sódio dependentes de voltagem. 2019. 79 f., il. Dissertação (Mestrado em Biologia Animal)—Universidade de Brasília, Brasília, 2019.
Abstract: Peçonhas de escorpiões são misturas ricas que compreendem compostos como enzimas, proteínas e peptídeos. A família Buthidae é a mais estudada dentre as famílias de escorpião devido aos envenenamentos de importância médica e ao seu potencial biotecnológico. Dentre as espécies conhecidas, pode-se destacar o escorpião Tityus serrulatus. Os peptídeos destas peçonhas podem ser classificados em dois grupos, os peptídeos sem pontes dissulfeto (NDBP), que podem ter ação antimicrobiana e os peptídeos com pontes dissulfeto (DBP), que se caracterizam pela ação em canais iônicos de membranas celulares como sódio (Na+) e potássio (K+). Os peptídeos que atuam em canais de sódio são denominados NaScTxs. Canais de sódio estão distribuídos por todo o corpo e são responsáveis pela iniciação e propagação do potencial de ação. Estruturalmente, esses canais possuem quatro domínios transmembrânicos, contendo cada um seis α-hélice (S1-S6) e duas ou três subunidades β. Existem nove isoformas de canais de sódio em mamíferos (Nav1.1 a Nav1.9), sendo que cada isoforma possui distribuição e função características. Mutações nesses canais podem acarretar em doenças conhecidas como canalopatias. A busca por compostos capazes de agir neles são importantes visando o desenvolvimento de futuros fármacos. Diversas toxinas do Tityus serrulatus já foram identificadas e isoladas, sendo que algumas já possuem caracterização eletrofisiológica em canais de sódio e/ou potássio. A Ts17 é um peptídeo que ainda não foi estudado, sendo conhecido apenas seu precursor. Essa toxina apresenta grande similaridade com peptídeos da classe das -NaScTxs, indicando uma possível ação nos canais Nav afetando sua inativação rápida. Sendo assim, o objetivo do estudo é isolar e caracterizar eletrofisiologicamente (patch-clamp) a toxina Ts17 em canais de sódio voltagem dependentes de humanos (Nav1.1 a Nav1.7). Para purificação da toxina a partir da peçonha bruta de T. serrulatus, foram necessárias três etapas de fracionamento cromatográfico em coluna de fase reversa. O peptídeo Ts17 eluiu a 32% de acetronitrila na cromatografia da peçonha bruta. O sequenciamento parcial e a massa monoisotópica [M+H]+ foram obtidos em MALDI-TOF. Obteve-se a sequência de 43 resíduos de aminoácidos dos 64 totais e a massa monoisotópica [M+H]+ de 7234,4212 Da. Os testes eletrofisiológicos foram feitos a uma concentração de 100 nM para todos os subtipos (Nav1.1-Nav1.7). A Ts17 alterou a probabilidade de abertura dos canais para potenciais mais hiperpolarizados, tanto na ativação quanto na inativação, sendo Nav1.2 a isoforma mais afetada para ativação e a isoforma Nav1.5 para inativação. Não foram observadas diferenças entre os testes com e sem pré pulso. Em relação a recuperação da inativação lenta dos canais, a maior alteração na variação do tau foi do subtipo Nav1.5, por fim, não foram observadas alterações na inativação rápida dos canais, prolongando-os. Dito isso, apesar de ter alta porcentagem de identidade com α-NaScTxs, a toxina possui características eletrofisiológicas de β-NaScTxs, pois altera o shift de voltagem dos subtipos de canais de sódio, além de reduzir a amplitude de corrente, podendo essa atividade oposta ao esperado ser devido à similaridade tridimensional de α e β-NaScTxs e orientação de ligação similares.
Abstract: Scorpion venoms are rich mixtures that comprise compounds as enzymes, proteins and peptides. The Buthidae family is the most studied of the scorpion families due to the poisonings and their biotechnological potential. Among the known species, we can highlight the scorpion Tityus serrulatus. The peptides of these venoms can be classified into two groups, no disulfide bridges peptide (NDBP) with antimicrobial action and disulfide bridges peptide (DBP) that are characterized by the action on ion channels of cellular membranes like Na+ and K+. Peptides that act on sodium channels are called NaScTxs. Sodium channels are distributed throughout the body and are responsible for the initiation and propagation of the action potential. Structurally, these channels have four transmembrane domains each containing six α-helices (S1-S6) and two or three β-subunits. There are nine isoforms of sodium channels in mammals (Nav1.1 to Nav1.9), each isoform with characteristic distribution and function. Mutations in these channels can lead to diseases known as channelopathies. The search for compounds capable of acting on them is important for the development of future drugs. Several toxins of Tityus serrulatus have already been identified and isolated, some with electrophysiological characterization in sodium and / or potassium channels. Ts17 is a peptide without studies about your function, only its precursor being known. This toxin presents great similarity with peptides of the class of -NaScTxs, indicating a possible action in the Nav channels affecting its rapid inactivation. The aim of the study is to isolate and characterize electrophysiologically (Patch-clamp) the Ts17 toxin in human-dependent voltage sodium channels (Nav1.1 to Nav1.7). The purification of the toxin from the crude venom of T. serrulatus occurred in three steps of reverse phase chromatographic fractionation, Ts17 eluted at 32% acetonitrile on crude venom chromatography. Partial sequencing and monoisotopic mass [M + H]+ were obtained in MALDI-TOF. The results showed 43 amino acid residues of 64 and the monoisotopic mass [M + H]+ of 7234.4212 Da. Electrophysiological tests were done at a concentration of 100 nM. The toxin altered the open probability of channels in activation and inactivation states, with Nav1.2 being the most affected isoform for activation and the Nav1.5 isoform for inactivation. No differences were observed between prepulse and non-prepulse tests. To the recovery (slow inactivation), the major tau variance was of the Nav1.5 subtype. Finally, no change in the rapid inactivation was evaluated. the toxin has high percentage of identity with α-NaScTxs, but functionally the toxin has characteristics of β-NaScTxs, because change the open probability of sodium channels, besides to reduce current amplitude. This opposite to expected activity can be by three-dimensional similarity between alfa and beta toxins and similar binding orientation of both.
Description: Dissertação (mestrado)—Fundação Universidade de Brasília, Programa de Pós-Graduação em Biologia Animal, 2019.
Licença:: A concessão da licença deste item refere-se ao termo de autorização impresso assinado pelo autor com as seguintes condições: Na qualidade de titular dos direitos de autor da publicação, autorizo a Universidade de Brasília e o IBICT a disponibilizar por meio dos sites www.bce.unb.br, www.ibict.br, http://hercules.vtls.com/cgi-bin/ndltd/chameleon?lng=pt&skin=ndltd sem ressarcimento dos direitos autorais, de acordo com a Lei nº 9610/98, o texto integral da obra disponibilizada, conforme permissões assinaladas, para fins de leitura, impressão e/ou download, a título de divulgação da produção científica brasileira, a partir desta data.
Agência financiadora: Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES), Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) e Fundação de Apoio à Pesquisa do Distrito Federal (FAPDF).
Appears in Collections:IB - Mestrado em Biologia Animal (Dissertações)

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