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Please use this identifier to cite or link to this item: http://repositorio.unb.br/handle/10482/35356
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Title: Proteômica top-down da bactéria produtora de aminoácidos Corynebacterium glutamicum
Authors: Melo, Reynaldo Magalhães
Orientador(es):: Vale, Luis Henrique Ferreira do
Assunto:: Corynebacterium glutamicum
Aminoácidos - produção
Microorganismos
Bactérias
Issue Date: 22-Aug-2019
Citation: MELO, Reynaldo Magalhães. Proteômica top-down da bactéria produtora de aminoácidos Corynebacterium glutamicum. 2019. 116 f., il. Dissertação (Mestrado em Biologia Microbiana)—Universidade de Brasília, Brasília, 2019.
Abstract: Corynebacterium glutamicum é uma bactéria utilizada em indústrias para produção de biomoléculas, existindo cepas capazes de produzir isobutanol, succinato, pantotenato, biopolímeros, entre outros. Apesar desse potencial, sua aplicação industrial mais relevante é na produção de aminoácidos, que é o terceiro grupo de moléculas mais produzido por fermentação no mundo. O sequenciamento do genoma dessa bactéria em 2003 possibilitou o desenvolvimento de novas cepas com mutações dirigidas. A proteômica apresenta grande potencial para a caracterização de funcionamento de vias metabólicas, sendo capaz de identificar modificações pós-traducionais (PTMs), conhecidas por seu papel na regulação do metabolismo. Nesse contexto, a proteômica top-down está ganhando espaço como abordagem para identificação de proteoformas, por ser capaz de identificar várias PTMs em proteomas complexos. Esse trabalho teve como objetivo caracterizar o proteoma de C. glutamicum, principalmente proteoformas de proteínas reguladoras da biossíntese de aminoácidos e propor mecanismos de regulação não descritos que podem melhorar a eficiência na produção de aminoácidos. Foram realizadas análises proteômicas top-down em amostras de C. glutamicum cultivadas em meio BT e CGXII. Em meio BT foram detectados 1873 PrSMs e identificadas 492 proteínas não redundantes com 681 proteoformas diferentes. As modificações identificadas foram clivagens e adições de grupamentos formil, acetil ou fosfato. Além disso pôde-se estabelecer condição de degradação proteolítica nessa amostra a partir da contagem de espectros. A análise de cultivo CGXII foi feita com tween 40, para estimular a produção de glutamato, e sem tween 40. A produção de glutamato e aspartato pode ser evidenciada na condição estimulante após 30 hs de estímulo. Apesar da produção de aminoácidos, não foi possível detectar diferenças estatísticas na quantidade de modificações entre as duas condições. Ademais, foi possível verificar efeito de degradação proteolítica muito menor nessas amostras quando comparadas à cultivadas em meio BT. No metabolismo de aminoácidos, foram detectadas proteoformas das enzimas lactato desidrogenase e treonina desidratase fosforiladas que sugerem mecanismo de regulação dessas enzimas por PTMs na biossíntese de L-glutamato, L-lisina e L-leucina. A identificação de vários níveis de PTM não caracterizada no banco de dados foi executada em proteína anotada por similaridade à subunidade da acetolactato sintase e em subunidade pequena da 3-isopropilmalato desidratase, ambas enzimas presentes na biossíntese de L-valina e L-leucina. As massas dessas PTMs sugerem a presença de estearoilção, possível mecanismo de regulação enzimática. Além da adição de grupamentos, foram detectadas proteoformas com pequenas clivagens em suas sequências, dentre elas a corismato mutase apresentou processamento não descrito no banco de dados. Essa clivagem em corismato mutase pode abalar a formação de supercomplexo entre unidades de corismato mutase e DAHP sintase e consequentemente afetar a produção de L-fenilalanina e L-tirosina.
Abstract: Corynebacterium glutamicum is a workhorse bacterium used to produce many biomolecules, among them there are strains capable to produce isobutanol, succinate, panthothenate, biopolimers and other compounds. Amino acids are the most explored group of molecules for industrial production in C. glutamicum. These are the third most produced biomolecules through fermentation worldwide. The C. glutamicum genome sequencing was published in 2003, and it increased our capacity to genetically modify it. Among the “omics”, proteomics presents great potential to characterize metabolic pathways, once it is able to identify PTMs that are required for metabolism regulation. Regarding proteomics, top-down proteomics is an approach which is growing within this field due to its capacity to identify many PTMs in complex proteomes. The objective of this project was to characterize the proteome of C. glutamicum, mainly those proteins related to amino acids metabolism. Also, propose regulations of mechanisms that can enhance amino acid production in this bacterium. Top-down proteomics experiments were performed in C. glutamicum samples cultivated in BT medium and CGXII medium. In BT medium were detected 1873 PrSMs having identified 492 were non-redundant proteins with 681 proteoforms. Those proteoforms were related to cleaveges and addition of groups such as formyl, acetyl and phosphates. These analyses were also able to detect sample proteolysis degradation through spectral counting. The CGXII medium was submitted to different conditions: i) with glutamate production, induced by addition of tween 40 and, ii) control condition, without tween 40. Glutamate production was observed after 30 hs of cultivation with tween 40 in contrast to the sample without this molecule, where glutamate production was not detected. Despite this phenotype, no significant changes in modifications patterns was observed by means of spectral counting. Furthermore, in this sample, the degradation effect observed was much less than the one detected in BT medium samples. Phosphorylated proteoforms identified suggest a potential amino acid metabolism regulation. Such proteins as lactate dehydrogenase and threonine dehydratase detected with phosphate addition group might infer a regulation in the biosynthesis of L-glutamate, L-lysine and L-Leucine. Moreover, it was identified mass shift patterns, suggesting different amounts of the same PTM into two proteins (3-isopropylmalate dehydratase and acetolactate synthase, annotated by similarity). These two proteins catalyze biosynthesis steps of L-valine and L-leucine. The mass shifts present in theses suggest different levels of stearoylation modification, possibly a new mechanism of regulation in this amino acid synthesis. Beyond group additions, proteoforms were detected with small sequence cleavages. Among them, chorismate mutase drives special attention because this protein is part of a supercomplex formed by chorismate mutase and DAHP synthase. Consequently, this cleavage could disturb the production of L-phenylalanine and L-tyrosine.
Description: Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Instituto de Biologia, Pós-Graduação em Biologia Microbiana, 2019.
Licença:: A concessão da licença deste item refere-se ao termo de autorização impresso assinado pelo autor com as seguintes condições: Na qualidade de titular dos direitos de autor da publicação, autorizo a Universidade de Brasília e o IBICT a disponibilizar por meio dos sites www.bce.unb.br, www.ibict.br, http://hercules.vtls.com/cgi-bin/ndltd/chameleon?lng=pt&skin=ndltd sem ressarcimento dos direitos autorais, de acordo com a Lei nº 9610/98, o texto integral da obra disponibilizada, conforme permissões assinaladas, para fins de leitura, impressão e/ou download, a título de divulgação da produção científica brasileira, a partir desta data.
Appears in Collections:IB - Mestrado em Biologia Microbiana (Dissertações)

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