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Title: Análise funcional e da diversidade de um consórcio microbiano capaz de degradar lignina
Authors: Mendes, Ísis Viana
Orientador(es):: Kruger, Ricardo Henrique
Assunto:: Lignina
Consórcios microbianos
Metagenômica
Issue Date: 22-Aug-2019
Citation: MENDES, Ísis Viana. Análise funcional e da diversidade de um consórcio microbiano capaz de degradar lignina. 2019. 163 f., il. Dissertação (Mestrado em Biologia Molecular)—Universidade de Brasília, Brasília, 2019.
Abstract: Dentro de um modelo de biorrefinarias, o melhor aproveitamento da biomassa lignocelulósica requer a degradação da lignina e o seu uso como matéria-prima na geração de bioprodutos. A lignina é a maior fonte de compostos fenólicos na natureza. A recalcitrância à conversão enzimática ainda é uma das etapas limitantes no processo de valorização da lignina. Na natureza, fungos e bactérias conseguiram driblar a recalcitrância da lignina e são capazes de degradá-la por meio de enzimas oxirredutases. No primeiro capítulo dessa dissertação, foi analisada a diversidade microbiana de quatro consórcios enriquecidos para microrganismos capazes de degradar lignina. Os consórcios foram obtidos a partir de solo comercial, cultivados a 30 ºC e 37 ºC e enriquecidos por meio de sucessivas passagens em meio de cultura onde lignina Kraft ou lignina extraída por método alcalino foi usada como fonte de carbono. Foi realizado o sequenciamento de iTags da região espaçadora transcrita interna ITS de fungos, e da região ribossomal 16S de bactérias, para cada um dos seis ciclos de adaptação (passagens). A análise da comunidade microbiana mostrou que a diversidade diminuiu gradualmente e a comunidade tende a se estabilizar em termo de composição a partir da quarta passagem. As variáveis substrato e temperatura atuam na modificação da composição de famílias em cada consórcio. Diferentes famílias bacterianas que atuam na degradação da lignina foram identificadas: Planococcaceae, Paenibacillaceae e Bacillaceae do filo Firmicutes; Rhodobacteraceae, Sphingomonadaceae, Methylobacteriaceae, Pseudomonadaceae, Brucellaceae, Burkholderiaceae, Phyllobacteriaceae e Erythrobacteraceae, do filo Protebacteria; Flavobacteriaceae do filo Bacteroidetes; e Microbacteriaceae do filo Actinobacteria. Espécies do filo Firmicutes e Proteobacteria foram favorecidas, respectivamente, pelo cultivo em lignina extraída por método alcalino e lignina Kraft. Para a comunidade fúngica, Trichosporonaceae, Trichocomaceae e Cephalothecaceae são as principais famílias encontradas ao final do processo de enriquecimento. Além disso, foram identificados ciliados que possivelmente desempenharam um papel importante na dinâmica evolutiva da comunidade microbiana. No segundo capítulo dessa dissertação, foi obtida uma biblioteca metagenômica, BElig MG 6P, com o DNA da sexta passagem do consórcio microbiano cultivado a 37 ºC e enriquecido com lignina extraída por método o alcalino. Os clones da biblioteca foram transformados em Escherichia coli HB101 e Pseudomonas putida KT2440. Duas abordagens foram utilizadas para triar essa biblioteca para clones que codifiquem enzimas ligninolíticas: uma metodologia funcional e outra baseada na sequência. A metodologia funcional é baseada no fenótipo das colônias que revelam atividades de enzimas ligninolíticas, sendo capazes de oxidarem os compostos aromáticos: guaiacol, catecol, 4-metilcatecol e ácido ferúlico ao longo de 24 horas. Sete potenciais clones positivos foram obtidos, mas apenas três foram sequenciados: P1 7A, P3 3G e P4 7G. ORFs de interesse foram obtidas por essa metodologia. Na metodologia baseada na sequência primers, previamente construídos a partir de domínios conservados de enzimas ligninolíticas já descritas, foram utilizados para amplificar fragmentos por reação em cadeia da polimerase (PCR), utilizando o DNA da biblioteca metagenômica BElig MG 6P como molde. Essa metodologia permitiu identificar uma lacase e uma metiltransferase, ambas de Escherichia coli. Uma metodologia adicional baseada na complementação da atividade em Pseudomonas putida KT2440 identificou potenciais clones positivos que convertem guaiacol em catecol permitindo que Pseudomonas putida KT2440 utilize o guaiacol como única fonte de carbono.
Abstract: In the biorefinery model, the best use of biomass requires the degradation of lignin, and its use for making bioproducts. Lignin is the major source of phenolic compounds in nature. Its resistance to enzymatic conversion remains one of the limiting steps for lignin valorization. In nature, fungi and bacteria are able to degrade lignin using ligninolytic enzymes. In the first chapter of this dissertation, the diversity and dynamics of four lignin-adapted microbial consortia that originated from a commercial soil sample, grown at 30 ºC and 37 ºC, were analyzed. Sequencing of iTags for the ITS region from fungi and 16S rDNA region from bacteria was performed for each of the six adaptation cycles (passages). Microbial community diversity analysis showed that diversity gradually decreases, and the community tends to stabilize in terms of its composition from the forth passage on forward. Different bacterial families that potentially degrade lignin were identified: Planococcaceae, Paenibacillaceae and Bacillaceae of phylum Firmicutes; Rhodobacteraceae, Sphingomonadaceae, Methylobacteriaceae, Pseudomonadaceae and Brucellaceae of phylum Proteobacteria, Burkholderiaceae and Flavobacteriaceae of phylum Bacteroidetes; and Microbacteriaceae of phylum Actinobacteria. Species of Firmicutes and Proteobacteria phyla were favored by enrichment with base-extracted lignin and kraft lignin, respectively. Trichosporonaceae, Trichocomaceae, and Cephalothecaceae were the main families found in the fungal community, in addition to the presence of Ciliophoras that possibly played an important role in the evolutionary dynamics of the microbial community. In the second chapter, a metagenomic library, BElig MG 6P, was obtained using microbial consortium DNA of the six passage from a culture maintained at 37 °C, which used base-extracted lignin as a carbon source. The library clones were transformed into Escherichia coli HB101 and Pseudomonas putida KT2440. To screen this library for lignolytic clones, two strategies were used: one based on function and another sequence-based. The functional methodology is based on the phenotype of the colonies that show activities of ligninolytic enzymes, being able to oxidize the aromatic compounds: guaiacol, catechol, 4-methylcatechol and ferulic acid over 24 hours. Seven potential positive clones were obtained, but only three were sequenced: P1 7A, P3 3G and P4 7G. ORFs of interest were obtained by this methodology. In the sequence-based methodology primers, previously designed from conserved domains present in bacterial lacases, were used to amplify fragments by polymerase chain reaction (PCR), using the DNA from the BElig MG 6P metagenomic library as template. This methodology allowed the identification of a laccase and a methyltransferase both from Escherichia coli. An additional complementation strategy for screening in Pseudomonas putida KT2440 identified potential positive clones that convert guaiacol to catechol allowing Pseudomonas putida KT2440 to use guaiacol as the only source of carbon.
Description: Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Departamento de Biologia Celular, Programa de Pós-Graduação em Biologia Molecular, 2019.
Licença:: A concessão da licença deste item refere-se ao termo de autorização impresso assinado pelo autor com as seguintes condições: Na qualidade de titular dos direitos de autor da publicação, autorizo a Universidade de Brasília e o IBICT a disponibilizar por meio dos sites www.bce.unb.br, www.ibict.br, http://hercules.vtls.com/cgi-bin/ndltd/chameleon?lng=pt&skin=ndltd sem ressarcimento dos direitos autorais, de acordo com a Lei nº 9610/98, o texto integral da obra disponibilizada, conforme permissões assinaladas, para fins de leitura, impressão e/ou download, a título de divulgação da produção científica brasileira, a partir desta data.
Agência financiadora: Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES).
Appears in Collections:CEL - Mestrado em Biologia Molecular (Dissertações)

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