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Please use this identifier to cite or link to this item: http://repositorio.unb.br/handle/10482/35242
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Title: Produção de quimosina bovina em clones de Komagataella phaffii contendo múltiplas cópias do gene codificador
Authors: Baptistello, Carolina de Souza
Orientador(es):: Torres, Fernando Araripe Gonçalves
Coorientador(es):: Marco, Janice Lisboa de
Assunto:: Quimosina recombinante bovina
Leite - coagulação
Komagataella phaffii
Leveduras - melhoramento genético
Issue Date: 7-Aug-2019
Citation: BAPTISTELLO, Carolina de Souza. Produção de quimosina bovina em clones de Komagataella phaffii contendo múltiplas cópias do gene codificador. 2019. vii, 65 f., il. Dissertação (Mestrado em Biologia Molecular)—Universidade de Brasília, Brasília, 2019.
Abstract: Quimosina é uma aspartil protease que catalisa a reação de hidrólise da κ-caseína, provocando a coagulação do leite. Esta enzima é amplamente utilizada na indústria queijeira, devido à sua especificidade e baixa atividade proteolítica, o que confere características organolépticas desejáveis e alto rendimento a produção de queijo. Neste trabalho, a quimosina bovina B foi produzida em K. phaffii e purificada. Para obtenção das linhagens contendo múltiplas cópias do gene da quimosina foram utilizados vetores integrativos com o gene CHYM sob o controle do promotor do gene PGK1 e a marca de seleção auxotrófica leu2-d. O cassete de expressão é flanqueado por sequencias de homologia a três loci genômicos: PGK1, 5S rDNA e uma sequências repetitiva do cromossomo 3. Clones selecionados de cada construção foram analisados quanto ao número de cópias, estabilidade genética e produção enzimática em frascos utilizando meios de cultura distintos. Os clones P33 (integração no lócus PGK1), R5 (integração no lócus 5S rDNA) e C32 (integração em uma sequência repetitiva do cromossomo 3) apresentam 20, 23 e 2 cópias respectivamente e todos se mostraram instáveis em meio de cultivo não seletivo. O maior valor de atividade enzimática foi obtido em meio YPD para clone C32 (183 UAC.mL-1). A quimosina recombinante foi purificada por cromatografia de gel filtração e analisada por SDS-PAGE. Foram encontradas duas formas da quimosina recombinante, uma com massa molecular de ~36 kDa, correspondente à enzima ativa e uma com massa molecular maior que corresponde a enzima glicosilada.
Abstract: Chymosin is an aspartic protease that catalyzes the hydrolysis reaction of k-casein, causing the milk clotting. This enzyme is widely used in the cheese industry, because its high specificity and low proteolytic activity, which gives desirable organoleptic properties and higher yield of cheese production. In this work, the bovine chymosin was produced in K. phaffii and purified. To obtain the strain containing multi-copy of chymosin gene integrative vector with CHYM gene under control of PGK1 promoter and the auxotrophic selection marker leu2-d have been used. The expression cassette is flanked by homology sequences to three target genomic loci: PGK1, 5S rDNA or a repetitive sequence of chromosome 3. Select clone of each construction was analyzed for copy number, genetic stability and the enzymatic production in flask using different culture media. The clones P33 (integration at the PGK1 locus), C32 (integration at repetitive sequence of chromosome 3) e R5 (integration at 5S rDNA) showed 20, 23 e 2 copies respectively and were unstable in non-selective culture media. The highest enzymatic activity was obtained in YPD media by C32 clone (183 UAC.mL-1). The recombinant chymosin was purified by gel filtration chromatography and analyzed by SDS-PAGE. Two forms of recombinant chymosin were found, one with molecular weight of ~36 kDa, which corresponds to active enzyme and another with higher molecular weight which corresponds to active and glycosylated enzyme.
Description: Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Departamento de Biologia Celular, Programa de Pós-Graduação em Biologia Molecular, 2019.
Licença:: A concessão da licença deste item refere-se ao termo de autorização impresso assinado pelo autor com as seguintes condições: Na qualidade de titular dos direitos de autor da publicação, autorizo a Universidade de Brasília e o IBICT a disponibilizar por meio dos sites www.bce.unb.br, www.ibict.br, http://hercules.vtls.com/cgi-bin/ndltd/chameleon?lng=pt&skin=ndltd sem ressarcimento dos direitos autorais, de acordo com a Lei nº 9610/98, o texto integral da obra disponibilizada, conforme permissões assinaladas, para fins de leitura, impressão e/ou download, a título de divulgação da produção científica brasileira, a partir desta data.
Agência financiadora: Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq).
Appears in Collections:CEL - Mestrado em Biologia Molecular (Dissertações)

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