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Please use this identifier to cite or link to this item: http://repositorio.unb.br/handle/10482/34462
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Title: Avaliação da ablação de CD90 em células primárias de glioblastomas humanos in vitro
Authors: Buzogany, Vanessa Henriques Nogueira
Orientador(es):: Oliveira, Daniela Mara de
Assunto:: Glioblastoma multiforme
Células-tronco
Tumores
Glicoproteína CD90
Expressão gênica
Issue Date: 26-Apr-2019
Citation: BUZOGANY, Vanessa Henriques Nogueira. Avaliação da ablação de CD90 em células primárias de glioblastomas humanos in vitro. 2018. 86 f., il. Dissertação (Mestrado em Biologia Animal)—Universidade de Brasília, Brasília, 2018.
Abstract: Os gliomas representam os tumores do sistema nervoso central (SNC) mais comuns e com alta taxa de incidência. Entre eles, o glioblastoma multiforme (GBM) é extremamente agressivo e com grande heterogeneidade intratumoral, sendo classificado como grau IV de acordo com a OMS. O paciente é submetido ao tratamento oncoquimioterápico, a Temozolomida, associado à radioterapia. Pouco se avançou em relação a evolução dos fármacos utilizados para o tratamento de GBM e os testes clínicos atuais revelam pouca melhora nas taxas de sobrevida, a qual é em média de 18 meses. Com a alta taxa de recidiva alinhada à falta de novos tratamentos, a busca por biomarcadores e a investigação biológica do GBM avançam de maneira promissora. Acredita-se que a resistência tumoral se deve à presença de células-tronco tumorais (CTC). Elas apresentam aspectos similares aos das células-tronco neuronais saudáveis, assim como a presença de certos marcadores moleculares indicadores um estado não diferenciado. A glicoproteína CD90 tem função de adesão celular no SNC e está presente em diversas células desse sistema. Porém, há estudos indicando uma superexpressão dessa proteína em CTCs de GBM, o que leva à investigação desse possível biomarcador em células primárias de GBM. A possibilidade de se utilizar de células de linhagens para o estabelecimento de metodologias e investigação de comportamentos in vitro, levou à análise da expressão de CD90 em U87MG, linhagem recorrente em estudos de GBM. Após a transdução com luciferase para futuros experimentos in vivo e ablação de CD90 para devida comparação com o controle e análise por citometria de fluxo, foi aferido que a linhagem U87MG é negativa para CD90, impossibilitando seu uso nos demais estudos. Dessa forma, amostras cirúrgicas humanas de GBM de dois pacientes foram processadas e, então, foi estabelecido o cultivo primário de GLIO1 e GLIO2. Após a ablação de CD90 nas duas amostras, obteve-se a confirmação, por citometria de fluxo, de que o grupo GLIO1 shCD90 e GLIO2 shCD90, teriam a expressão de CD90 reduzida em 42,78% e 68,6%, respectivamente. Assim, o ensaio de formação de oncoesferas foi realizado a fim de descobrir a influência de CD90 na formação de estruturas esferoides, as quais acredita-se serem compostas por CTCs. A ablação de CD90 influenciou na morfologia das oncoesferas, com menor densidade e com menor tamanho, e no número dessas estruturas entre 3 a 7 dias de cultivo, quando comparada com o grupo controle, tanto em GLIO1 quanto em GLIO2. Foi avaliada, também, a migração celular pelo teste in vitro de wound healing e CD90 demonstrou influência no tempo de fechamento da área do scratch, com o grupo GLIO2 shCD90 não tendo a mesma capacidade de migração celular quanto o grupo controle, GLIO2 WT. Ao mesmo tempo, realizou-se o teste de adesão por análise celular em tempo real (RTCA), o qual comprovou a influência da gliocoproteína na adesão e espalhamento das células em baixa (5x103), média (10x103) e alta (20x103) confluências. Portanto, esse trabalho permite inferir a influência do nível de expressão de CD90 em células primárias de GBM, sendo importante na migração, invasão e formação de nichos com CTCs, os quais irão propagar o tumor e conferir maior resistência oncoquimioterápica. Além disso, é evidenciada a importância de se realizarem mais estudos com o cultivo primário devido às diferenças biológicas encontradas nas duas amostras de tumor. A maior investigação de CD90 permitirá tanto a busca para tratamentos mais eficazes quanto para a predição do prognóstico mais assertivo quanto à característica tumoral.
Abstract: Gliomas are the most common among the central nervous system (CNS) tumors and with high incidence rate. Among them, the glioblastoma multiforme (GBM) is extremely aggressive and with high intratumoral heterogeneity, classified as grade IV, accordingly to WHO. The patient is subjected to an oncochemotherapy, Temozolomida, associated with radiotherapy. Little progress has been made in the evolution of drugs used to treat GBM and current clinical trials show little improvement in survival rates, which is on average 18 months. With a high rate of relapse and with the lack of new treatments, the search for biomarkers and the biological investigation of the GBM are advancing in a promising way. Tumor resistance is believed to be due to the presence of tumor stem cells (CSCs). They present similar aspects to those of healthy neural stem cells, as well as the presence of certain molecular markers indicating an undifferentiated state. The glycoprotein CD90 is a cellular adhesion molecule in the CNS and is present in several cells of this system. However, there are studies indicating an overexpression of this protein in GBM CTCs, which leads to the investigation of this possible biomarker in primary GBM cells. The possibility of using cell lines to establish methodologies and investigation of in vitro behaviors led to the analysis of CD90 expression in U87MG, a recurrent cell line in GBM studies. After transfection with luciferase, for further in vivo experiments, and knockdown of CD90 for comparison with control and analysis by flow cytometry, it was verified that the U87MG is negative for CD90, making it impossible to use it in the other studies. Thus, GBM human surgical specimens from two patients were processed and then the primary culture of GLIO1 and GLIO2 was established. After the knockdown of CD90 in the two samples, it was confirmed by flow cytometry that the CD90 knockdown group, GLIO1 shCD90 and GLIO2 shCD90, would have CD90 expression reduced by 42.78% and 68.6 %, respectively. Therefore, the tumorsphere formation assay was performed in order to discover the influence of CD90 on the formation of spheroid structures, which are believed to be composed of CTCs. The knockdown of CD90 influenced the morphology of the tumorspheres, with lower density and with smaller size, and in the number of these structures between 3 and 7 days of culture, when compared with the control group, in GLIO1 and GLIO2. Cell migration was evaluated by the in vitro wound healing assay and CD90 showed influence on the scratch area closure time, with the GLIO2 shCD90 group not having the same cell migration capacity as the control group, GLIO2 WT. At the same time, the cell adhesion was performed in the real-time cell analysis (RTCA), which proved the influence of the glycocoprotein on cell adhesion and spreading at low (5x103), medium (10x103) and high (20x103) confluences. Therefore, this work allows to infer the influence of CD90 expression level on primary GBM cells, being important in the migration, invasion and formation of niches with CSCs, which will propagate the tumor and confer greater oncochemotherapy resistance. In addition, the importance of conducting further studies with primary culture is evident, as there were biological differences found between the two tumor samples. Further investigation of CD90 will allow both the search for more effective treatments and the prediction of the more assertive prognosis regarding the tumor characteristic.
Description: Dissertação (mestrado)—Fundação Universidade de Brasília, Programa de Pós-Graduação em Biologia Animal, 2018.
Licença:: A concessão da licença deste item refere-se ao termo de autorização impresso assinado pelo autor com as seguintes condições: Na qualidade de titular dos direitos de autor da publicação, autorizo a Universidade de Brasília e o IBICT a disponibilizar por meio dos sites www.bce.unb.br, www.ibict.br, http://hercules.vtls.com/cgi-bin/ndltd/chameleon?lng=pt&skin=ndltd sem ressarcimento dos direitos autorais, de acordo com a Lei nº 9610/98, o texto integral da obra disponibilizada, conforme permissões assinaladas, para fins de leitura, impressão e/ou download, a título de divulgação da produção científica brasileira, a partir desta data.
Agência financiadora: Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) e Fundação de Apoio à Pesquisa do Distrito Federal (FAP-DF).
Appears in Collections:IB - Mestrado em Biologia Animal (Dissertações)

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