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Please use this identifier to cite or link to this item: http://repositorio.unb.br/handle/10482/34224
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Title: Efeito antimicrobiano e citolítico da trialisina recombinante da saliva de Triatoma infestans
Authors: Corrêa, Patrícia Spoto
Orientador(es):: Teixeira, Antônio Raimundo Lima Cruz
Coorientador(es):: D'Souza-Ault, Marian
Assunto:: Chagas, Doença de
Barbeiro (Triatomíneo)
Triatoma - saliva
Antimicrobiano
Issue Date: 26-Mar-2019
Citation: CORRÊA, Patrícia Spoto. Efeito antimicrobiano e citolítico da trialisina recombinante da saliva de Triatoma infestans. 2002. iv, 142 f., il. Tese (Doutorado em Patologia Molecular)—Universidade de Brasília, Brasília, 2002.
Abstract: Insetos hematófagos têm grande interesse médico-biológico devido a transmissão de doenças endêmicas de alta prevalência, morbidade e mortalidade em populações humanas e de animais, em todos os continentes. Por exemplo, a doença de Chagas transmitida pelo triatomineo Triatoma. infestans está amplamente distribuída no continente americano, onde cerca de 18 milhões de pessoas já estariam infectadas com o Trypanossoma. cruzi, o agente causai da doença. Esses insetos produzem e armazenam proteínas farmacologicamente ativas em suas glândulas salivares, e as inoculam no hospedeiro durante o repasto. Ao inibir os mecanismos homeostásicos da sua presa, essas bioaminas facilitam o repasto do inseto e a transmissão do agente patógeno. O estudo de proteínas salivares com notável efeito farmacológico pode ser útil no estudo da filogenia e diversidade genética de insetos, mas elas também poderiam ser usadas como ferramentas para a caracterização dos processos hematológicos, vasculares, e teciduais relacionados às modificações que ocorrem no sítio da picada. Contudo, nós achamos que, igualmente importante, seria a produção de uma vacina contra a picada do inseto hematófago, criando imunoprofilaxia contra a transmissão do T. cruzi. A produção de vacina com proteínas recombinantes expressas na glândula salivar do triatomineo é um objetivo em longo prazo no Laboratório Multidisciplinar de Pesquisa em Doença de Chagas. O trabalho aqui apresentado faz parte dessa estratégia visando á identificação de genes e expressão de proteínas recombinantes com funções importantes no repasto do inseto, Nós analisamos 20 clones oriundos de uma biblioteca de cDNA de glândula salivar de T. infestans. As seqüências gênicas desses clones mostraram similaridade, e não descartamos a possibilidade de se tratar de uma família mulíigênica. A proteína recombinaníe resultante da expressão do clone 30/LMPDC recebeu o nome de rTrialisina. Ainda que a seqüência do clone 30/LMPDC tenha 97% de similaridade com o gene da Trialisina (Amino e cols., 2002), nós obtivemos a expressão da rTrialisina e descrevemos suas características funcionais ainda desconhecidas. Ademais, a modelagem molecular permitiu-nos conhecer parte da estrutura terciária da proteína e seu sítio ativo foi predito, o que também eram desconhecidos. O cDNA completo do gene da Triaiisina que codifica a pró-proteína foi inserido em um vetor de expressão de proteínas de fusão pGEX-5x-3. A proteína de fusão foi expressa sob a indução de 1PTG em E. coli BL21(DE3) e purificada em cromatografia de afinidade com agarose ligada à glutationa. A proteína recombinante (rTrialisina) ativada pela saliva de T. infestans mostrou efeito citolítico sobre E. coli, T. cruzi, L donovani e células murinas da linhagem L6. A atividade fosfoiipásica A2 da ririalisina estaria relacionada com a sua atividade lítica formadora de poros. A rTrialisina foi expressa em E. coli e a proteína recombinante foi utilizada para a imunização de coelhos. Os anticorpos policlonais obtidos localizaram a expressão da proteína no primeiro par de glândulas salivares do inseto. De grande interesse, esses anticorpos inibiram parcialmente a atividade citolííica da rTrialisina in vitro. Em resumo, os resultados desse trabalho adicionam informações e insumos para a avaliação da estratégia montada pela equipe de pesquisadores do LMPDC. Nós postulamos que juntamente com outras proteínas da saliva do triatomíneo, a rTrialisina deve ser testada como fração de imunógenos na formulação de vacina polivalente visando a imposição de dificuldades ao repasto do inseto hematófago transmissor da doença de Chagas. Uma possível atividade imunobiológica ou biotecnológica da rTrialisina deverá ser avaliada após sua expressão em vetor indicado para produção em larga escala. Diante desse potencial, a aplicabilidade da rTrialisina e de outras proteínas recombinantes produzidas no LMPDC deverão ser submetidos ao processo de patente.
Abstract: Blood-sucking insects have been studied for their bio-medical importance associated with the transmission of prevalent endemic diseases showing high morbidity and mortality ali over the world. For exampie, Chagas disease transmitted by the reduviid bug {Hemíptera: Reduviidae) T. infestans is broadly distributed in the American Continent, where 18 millíon people became infected with T. cruzi, the causai agent of the disease These insects store and secreíe in their salivary gland pharmacologically active proíeins, and insert these into the host during feeding. The host homeostatic inhibition mechanisms help insectfeeding and the pathogen transfer. The study of salivary proteins study with notable pharmacologicai effect may be useful in understanding the genetic diversity and biogenetics of the insects, but it can be used as a tool for characterization of the hematological, vascular and tissue specific hematological processes. Therefore we see the importance of vaccine production against the hemathophagous insect bite, as prophylaxis against T. cruzi transmission. The vaccine production with recombinant protein expressed in the triatomine salivary gland is a future project in the LMPDC. The work we have presented here is part of this strategy that iníends to identify genes and express recombinant proteins with important functions for insect feeding. We have analyzed 20 clones from the T. infestans salivary gland cDNA library. These clones sequences showed high similarity, and we donl discard the possibility of a multigene family. The recombinant protein that resulted from expression of the clone 30/LMPDC was named rThalysin. The rThalysin sequence showing 97% homology with Triaiysin's gene (Amino et al., 2002) was further subjected to expression and the still unknown recombinant protein functionat characterization was described. In addition, the molecular modeling hetped to know part of the tertiary structure and the active site could be predicted. The complete Trialysin cDNA that codes for a pre-protein was inserted mto a fusion protein expressiion vector pGEX-5x-3. The fusion protein was expressed with IPTG induction in E. coli BL21(DE3) and purified by affinity chromatography with glutathione agarose. The recombinant protein processed by T. infestans saliva-.showed cytolytic effect against E. coli. T. cruzi, L. donovani and murine L6 cells. The rTrialysin phospholipase A2 activity could be related to pore-forming activity of the rTrialysin. The rTrialysin was expressed in E. coli and the recombinant protein was used to immunize rabbits. The polyctonal antibodies recognized the native Trialysin in the first pair of salivary glands in the insect. These antibodies also inhibited partially the rTrialysin cytolyses in vitro. In summary, the results of this work add information and evaluate the strategy set forth by the LMPDC staff researchers. We have planned that together with oíher proteins from the Triatomine salivary gland the rTrialysin should be tested with immunogenic fractions in the polyvalent vaccine preparation, creating difficulty for the haematophagous insect feeding vector of Chagas disease. Hence the immunobiological and biothecnological activities or the rTrialysin should be evaluated after expression on large scale. The rTrialysin and the other recombinant proteins expressed exclusively in the Triatomine salivary glands is promising for the future and therefore, its applicability needs Paíent protection.
Description: Tese (doutorado)—Universidade de Brasília, Faculdade de Medicina, 2002.
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