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Título: Norovírus humano GII.4-Sydney : caracterização molecular e desenvolvimento de clone infeccioso e replicon
Autor(es): Portela, Layssa Miranda de Oliveira
Orientador(es): Nagata, Tatsuya
Coorientador(es): Blawid, Rosana
Assunto: Norovírus humano
Vírus - aspectos genéticos
Patologia molecular
Gastroenterite
Data de publicação: 1-Fev-2019
Referência: PORTELA, Layssa Miranda de Oliveira. Norovírus humano GII.4-Sydney: caracterização molecular e desenvolvimento de clone infeccioso e replicon. 2018. 87 f., il. Tese (Doutorado em Biologia Molecular)—Universidade de Brasília, Brasília, 2018.
Resumo: Norovírus humano (HuNoV) é uma das principais causas de gastroenterite aguda no mundo sendo responsável por mais de 20% de casos. Esta alta incidência concentrou a atenção para as estratégias de prevenção, especialmente no entendimento da epidemiologia molecular dos norovirus (HuNoV) e para a melhor compreensão dos mecanismos de replicação dos norovirus. Por isso, a genética reversa de HuNoV pode ser uma ferramenta útil para elucidar os processos de infecção viral e mecanismo de replicação. Esse estudo propõe a análise de sequenciamento genômico, desenvolvimento do clone infeccioso e replicon, estudar a localização intracelular da Helicase e RdRp viral. Nesse trabalho foi desenvolvido um método rápido de construção de um clone de cDNA infeccioso de HuNoV usando a técnica Gibson Assembly. Dois genomas de dois isolados HuNoV-393 e HuNoV-666 foram clonados em pCR4-Topo e sequenciados. O relacionamento filogenético baseado nos genes da RNA polimerase (RdRP) e capsídeo (VP1) foram comparativamente analisados com as variantes de GII.4. O genoma completo de HuNoV-393 (GII.4 subtipo Sydney) foi clonado no vetor plasmidial pcDNA 3.1 previamente modificado. Para monitorar a replicação viral in vitro, o gene repórter da proteína fluorescente verde (GFP) foi fusionado nas posições entre os genes Helicase e p22 também por Gibson Assembly para construir o replicon pHuNoV-GFP. As células humanas Caco-2 foram transfectadas com o clone infeccioso contendo cDNA genômico completo e replicon com GFP. A detecção de VP1 em células transfectadas mostraram a evidência indireta da replicação de HuNoV. Desta forma, o clone infeccioso e replicon com GFP para o HuNoV GII.4 subtipo Sydney, constitui uma ferramenta valiosa para o estudo de replicação dos norovírus humano. Nesta tese foi iniciado o estudo dos sítios de replicação do HuNoV por meio do estudo dos genes Helicase e RdRp. Nesse trabalho optamos por clonar os genes Helicase e RdRp em ambas posições N e C-terminal do gene reporter GFP, porém não observamos diferenças de expressão significativa entre as construções RdRp-C e RdRp N-terminal, e com Helicase-N foi observado uma baixa expressão. Experimentos adicionais serão necessários para confirmar a localização das proteínas Helicase e RdRp.
Abstract: Human norovirus (HuNoV) is one of the main cause of acute gastroenteritis worldwide responsible for at least 20% of all cases. The higher incidence payed attention on prevention strategies, especially in understand the molecular epidemiology of norovirus (HuNoV) and for a betther understanding of norovirus replication mechanisms. Therefore, reverse genetics of HuNoV might be a useful tool to elucidate viral infection processes and replication mechanisms. This study proposes the analysis of genomic sequencing, development of the infectious clone and replicon, to study intracellular location of the viral Helicase and RdRp. In this work developed a rapid method constructing an infectious cDNA clone of HuNoV using Gibson Assembly technique. Two genomes of HuNoV GII.4 (HuNoV-393 and HuNoV-666) were cloned into pCR4-Topo and sequenced. The phylogenetic relationship based RdRp and VP1 genes were comparatively analysed with the GII.4 variant. The complete genome of the HuNoV-393 (GII4 subtype Sydney) was cloned into the previously modified pcDNA 3.1. To monitor viral replication in vitro, the reporter gene of green fluorescent protein (GFP) was fused at position between Helicase and p22 genes also by Gibson Assembly to construct the pHuNoV-GFP replicon. Human Caco-2 cells were transfected with the full-length genomic clone and replicon with GFP. A detection of VP1 in transfected cells showed the indirect evidence of HuNoV replication. So, the infectious clone and replicon with GFP of HuNoV GII.4 subtype Sydney, is a valuable tools for study in human norovirus replication. In this thesis the study of HuNoV replication sites was started studying the Helicase and RdRp genes. In this work we cloned the Helicase and RdRp genes in both N and C-terminal position of the reporter gene GFP, but we didn´t observe significant differences between the RdRp-C and RdRp N-terminal constructs, and the Helicase-N was observed at low expression level. Additional experiments will be need to confirm the location of Helicase and RdRp proteins.
Informações adicionais: Tese (doutorado)—Universidade de Brasília, Departamento de Biologia Celular, Instituto de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Biologia Molecular, 2018.
Licença: A concessão da licença deste item refere-se ao termo de autorização impresso assinado pelo autor com as seguintes condições:Na qualidade de titular dos direitos de autor da publicação, autorizo a Universidade de Brasília e o IBICT a disponibilizar por meio dos sites www.bce.unb.br, www.ibict.br, http://hercules.vtls.com/cgi-bin/ndltd/chameleon?lng=pt&skin=ndltd sem ressarcimento dos direitos autorais, de acordo com a Lei nº 9610/98, o texto integral da obra disponibilizada, conforme permissões assinaladas, para fins de leitura, impressão e/ou download, a título de divulgação da produção científica brasileira, a partir desta data.
Agência financiadora: Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES).
Aparece nas coleções:CEL - Doutorado em Biologia Molecular (Teses)

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