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Título: Novas aplicações do diagnóstico pré-natal não invasivo pela análise do plasma materno
Autor(es): Santa Rita, Ticiane Henriques
Orientador(es): Barra, Gustavo Barcelos
Assunto: Plasma materno
Pré-natal
DNA fetal
Feto
Genética forense
Data de publicação: 27-Nov-2018
Referência: SANTA RITA, Ticiane Henriques. Novas aplicações do diagnóstico pré-natal não invasivo pela análise do plasma materno. 2018. 107 f., il. Tese (Doutorado em Ciências da Saúde)—Universidade de Brasília, Brasília, 2018.
Resumo: A descoberta do DNA fetal livre de células na circulação materna viabilizou o desenvolvimento de tecnologias para o diagnóstico pré-natal não invasivo. Neste trabalho foram desenvolvidos três estudos independentes relacionados a este tema. O objetivo do primeiro estudo foi determinar o haplótipo Y-STR do feto no plasma materno durante a gravidez e estimar, de forma não invasiva, se o suposto pai e feto pertencem à mesma linhagem masculina. O estudo incluiu casais com gravidez única e paternidade supostamente conhecida. O sangue periférico foi coletado em tubos EDTA (mãe) e em papel FTA (pai). O DNA do plasma materno foi extraído usando NucliSens EasyMAG (Biomerieux). O sexo fetal foi determinado por qPCR pesquisando o alvo DYS-14 no plasma materno e também foi confirmado após o parto. Dos voluntários incluídos, 20 mães com fetos masculinos e 10 mães com fetos femininos foram selecionadas para a análise de Y-STR. A moda da idade gestacional foi de 12 semanas. Todas as amostras de DNA foram submetidas a amplificação por PCR com kits PowerPlex Y23, ampFLSTR Yfiler e dois multiplexes próprios, que em conjunto representam 27 diferentes Y-STR. Os produtos de PCR foram detectados no analisador genético 3500 e foram analisados usando o software GeneMapper-IDX (Life Technologies). Os haplótipos fetais (formato Yfiler) foram comparados com outros 5328 haplótipos brasileiros disponíveis no banco de dados de referência de haplótipos cromossômicos Y (YHRD). Como resultado, entre 22 e 27 loci foram amplificados com sucesso a partir do plasma materno em todos os 20 casos de fetos masculinos. Nenhuma das mulheres com fetos femininos apresentou um haplótipo Y-STR falsamente amplificado. O haplótipo detectado no plasma materno correspondeu ao haplótipo do pai alegado em 16 dos 20 casos. Quatro casos apresentaram inconsistências simples e que não configuravam exclusões; 1 caso mostrou uma mutação no locus DYS458 devido à contração de uma unidade repetição e 3 casos apresentaram “dropout” em um dos locus DYS385 I/II. Todas as inconsistências foram 6 confirmadas após o nascimento do bebê. Dezesseis haplótipos fetais não foram encontrados em YHRD e um deles apresentou mutação, o que corresponde à probabilidade de paternidade de 99,9812% e 95,7028%, respectivamente. Três haplótipos fetais ocorreram duas vezes no YHRD, o que corresponde à probabilidade de paternidade de 99,9437%. Em conclusão, um haplótipo Y-STR fetal discriminatório pode ser obtido da análise do plasma materno durante a gravidez a partir da décima segunda semanas de gestação. Todos os fetos masculinos puderam ser atribuídos à linhagem masculina do pai alegado no início da gravidez. A alta probabilidade de paternidade associada a cada caso sugere que a relação não é aleatória e essa estratégia pode ser usada como alternativa para análise de parentesco fetal masculino. Posteriormente foi questionado se o DNA fetal estaria presente na microcirculação materna e se a determinação não invasiva do sexo fetal utilizando o sangue capilar coletado por punção digital é comparável aos resultados obtidos do plasma isolado do sangue venoso. Desta forma, o segundo estudo envolveu 101 voluntárias grávidas. A mediana da idade gestacional (min–max) foi 11 (8–20) semanas. Inicialmente o desenho experimental do estudo foi prospectivo. No entanto, após iniciar os experimentos resultados falsos positivos para o DNA masculino foram identificados nas amostras de sangue capilar usando um protocolo de assepsia com álcool isopropílico. Suspeitou-se da contaminação da pele dos dedos maternos com DNA exógeno masculino. Subsequentemente novos protocolos de assepsia do local de coleta do sangue capilar (ponta dos dedos) foram implementados (hipoclorito de sódio 0,5% tamponado aplicado duas vezes e hipoclorito de sódio 1% tamponado aplicado uma vez). Os resultados obtidos do plasma isolado do sangue venoso e capilar foram comparados com o sexo do recém-nascido ao nascimento. As análises revelaram que a sensibilidade e especificidade da determinação do sexo fetal no sangue venoso comparado ao sexo no nascimento foi 100% (95%IC 93- 100%) e 100% (95%IC 93-100%). No sangue capilar, os resultados foram 100% (95%IC 78-100%) e 58% (95%IC 27-84%) para o grupo do álcool isopropílico, 100% (95%IC 83-100%) e 100% (95%IC 82-100%) para o grupo do hipoclorito de sódio tamponado à 0,5%, e 100% (95%IC 80-100%) e 100% (95%IC 81-100%) para o grupo do hipoclorito de sódio tamponado à 1%, respectivamente. Em conclusão, o DNA fetal está presente no sangue capilar materno permitindo a determinação não invasiva do sexo fetal. O DNA masculino exógeno pode estar presente nas pontas dos dedos das mulheres grávidas e ser detectável gerando resultados falsos positivos. Por isto, a eliminação do DNA masculino exógeno é crítica para uma confiável determinação do sexo fetal usando o sangue capilar materno. As soluções de hipoclorito de sódio diluído e tamponado, entre 0,5% e 1% pode ser usado para eliminar o DNA masculino exógeno das pontas dos dedos das mulheres grávidas. Por fim, o uso do cromossomo Y no diagnóstico pré-natal não invasivo limita sua aplicação aos fetos masculinos. Portanto, seria importante o desenvolvimento de tecnologias para análise do DNA fetal independentemente do sexo fetal e que contemple os cromossomos autossômicos. Assim, hipotetizou-se usar os polimorfismos de inserção e deleção (Indels) presentes no pai e ausentes na mãe como “pequenas ilhas” de diferenças genéticas entre mãe e feto para o estudo pré-natal não invasivo das características genéticas do feto. Entretanto, antes de desenvolver esta metodologia seria necessário conhecer as frequências alélicas e os parâmetros forenses destes Indels usando um conjunto de marcadores que tenha sido previamente validado e de preferência na população local. O tema de pesquisa do terceiro estudo foi avaliar as frequências alélicas de 38 indels na população do Distrito Federal. Os resultados indicam que este conjunto é um sistema genético altamente informativo, pois a probabilidade de discriminar dois indivíduos selecionados ao acaso é de 99,9999999999993% e a probabilidade de excluir um indivíduo falsamente acusado em um caso de paternidade é 99,81%. Com base nas frequências alélicas foram calculadas as distâncias genéticas da população estudada (Distrito Federal) em relação as populações descritas em outros estudos (Portugal, África, Ásia, tribo Terena e do estado do Rio de Janeiro). A análise das distâncias genéticas entre as diferentes populações revelou que o Distrito Federal é mais semelhante ao Rio de Janeiro, assumindo uma posição intermediária em relação à Europa e Rio de Janeiro - Afrodescendente e foi distante dos nativos americanos, africanos e do leste asiático. Esta conclusão está de acordo com a composição da população relatada no Censo 2010, em que a maioria dos imigrantes era do Nordeste e do Sudeste. Estes três estudos foram aprovados por comitês de ética locais e todos os participantes assinaram o termo de consentimento livre esclarecido.
Abstract: The discovery of cell-free fetal DNA in the maternal circulation enabled the development of technologies for noninvasive prenatal diagnosis. In this work, three independent studies related to this topic were developed. The aim of the first study is to determine the fetus YSTR haplotype in maternal plasma during pregnancy and estimate, non-invasively, if the alleged father and fetus belong to the same male lineage. The study enrolled couples with singleton pregnancies and supposedly known paternity. Peripheral blood was collected in EDTA tubes (mother) and in FTA paper (father). Maternal plasma DNA was extracted by using NucliSens EasyMAG. Fetal gender was determined by qPCR targeting DYS-14 in maternal plasma and it was also confirmed after the delivery. From all included volunteers, 20 mothers bearing male fetuses and 10 mothers bearing female fetuses were selected for the Y-STR analysis. The mode gestational age was 12 weeks. All DNA samples were subjected to PCR amplification by PowerPlex Y23, ampFLSTR Yfiler, and two in-house multiplexes, which together accounts for 27 different Y-STR. The PCR products were detected with 3500 Genetic Analyzer and they were analyzed using GeneMapper-IDX. Fetuses’ haplotypes (Yfiler format) were compared to other 5328 Brazilian haplotypes available on Y-chromosome haplotypes reference database (YHRD). As a result, between 22 and 27 loci were successfully amplified from maternal plasma in all 20 cases of male fetuses. None of the women bearing female fetuses had a falsely amplified Y-STR haplotype. The haplotype detected in maternal plasma completely matched the alleged father haplotype in 16 out of the 20 cases. Four cases showed single mismatches and they did not configure exclusions; 1 case showed a mutation in the DYS458 locus due to the loss of one repeat unit and 3 cases showed one DYS385I/II locus dropout. All mismatches were confirmed after the delivery. Seventeen fetuses’ haplotypes were not found in YHRD and one of them had a mutation, which corresponded to the paternity probability of 99.9812% and 95.7028%, respectively. Three fetuses’ haplotypes occurred twice in YHRD, which corresponded to paternity probability of 99.9437%. In conclusion, high discriminatory fetal Y-STR haplotype could be determined from maternal plasma during pregnancy starting at 12 weeks of gestation. All male fetuses could be attributed to the alleged father male lineage early in pregnancy. The high probability of paternity associated with each case suggests that the relationship is not random and this strategy can be use as an alternative for male fetal kinship analysis. Posteriorly, questioned whether the presence of fetal DNA on maternal microcirculation and investigate whether the fetal sex determination performed on plasma isolated from capillary blood is comparable to results obtained using plasma isolated from venous blood. Thus, the second study involved 101 pregnant volunteers. The median (min–max) gestational age was 11 (8–20) weeks. The initial study design was prospective. However, after commencement of the study the appearance of false positive results for male DNA among the capillary samples lead us to suspect maternal skin contamination with exogenous male DNA. We subsequently instituted new skin-cleansing protocols for the capillary samples (isopropyl alcohol, 0.5% buffered sodium hypochlorite applied twice and 1% buffered sodium hypochlorite applied once), and compared with these results with our plasma samples. The analysis reveled that, compared to the clinical examination at birth, sensitivity and specificity of the fetal sex determination in venous blood was 100% (95%CI 93-100%) and 100% (95%CI 93-100%). In capillary blood, results were 100% (95%CI 78- 100%) and 58% (95%CI 27-84%) for the isopropyl alcohol group, 100% (95%CI 83-100%) and 100% (95%CI 82-100%) for the 0.5% buffered sodium hypochlorite group and 100% (95%CI 80-100%) and 100% (95%CI 81- 100%) for 1% buffered sodium hypochlorite group, respectively. In conclusion, fetal DNA is present in maternal capillary blood allowing for non-invasive fetal sex determination. Exogenous male DNA may be present, and detectable, on the fingertips of pregnant women. So, the elimination of the exogenous male DNA is critical for a reliable fetal sex determination using maternal capillary blood. A diluted buffered sodium hypochlorite (0.5% - 1%) can be used to eliminate exogenous male DNA from the fingertips of pregnant women. Exploration of the Y chromosome in non-invasive prenatal diagnosis limits its application to male fetuses. Thus, it is important to develop technologies for fetal DNA analysis regardless of the fetal sex and that contemplate the autosomal Chromosomes. Thus, it was hypothesized to use insertion and deletion polymorphisms (Indels) present in the father and absent in the mother as "small islands" of genetic differences between mother and fetus for the non- invasive prenatal study of genetic characteristics of the fetus. However, before developing this methodology it is necessary to know the allelic frequencies and the forensic parameters of these Indels using a set of markers that has been previously validated and preferably in the local population. Thus, the third study was to evaluate the allelic frequencies of 38 indels in the population of the Federal District. The results indicate that this set is a highly informative genetic system. Therefore, the probability of discriminating two individuals selected at random is 99.9999999999993% and the probability of excluding a falsely accused individuals in a paternity case is 99.81%. Based on the allelic frequencies, the genetic distances of the study population (Federal District) were calculated in relation to the populations described by different studies (Portugal, Africa, Asia, Terena and Rio de Janeiro). Furthermore, analysis of genetic distances between diferents populations revealed that Federal District was plotted closer of Rio de Janeiro. Moreover, it assumed an intermediate position relative to Europe and RJ-AFD and was quite distant from Native Americans, Africans and East Asians. This conclusion agrees with the population composition reported in the 2010 National Survey Inquiries, in which most of the immigrants were from the northeast and the southeast. The studies developed were approved by a local ethics committee and all participants signed the informed consent form.
Informações adicionais: Tese (doutorado)—Universidade de Brasília, Faculdade de Ciências da Saúde, Programa de Pós-Graduação em Ciências da Saúde, 2018.
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