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Título: Identificação de microRNAs de macrófagos murinos expressos diferencialmente em resposta à infecção por Paracoccidioides brasiliensis
Autor(es): Rios, André Victor Gonçales Rodrigues
Orientador(es): Pereira, Ildinete Silva
Assunto: MicroRNA
Resposta imunológica
Resposta inflamatória
Paracoccidioides brasiliensis
Macrófagos
Data de publicação: 22-Out-2018
Referência: RIOS, André Victor Gonçales Rodrigues. Identificação de microRNAs de macrófagos murinos expressos diferencialmente em resposta à infecção por Paracoccidioides brasiliensis. 2018. 71 f., il. Dissertação (Mestrado em Patologia Molecular)—Universidade de Brasília, Brasília, 2018.
Resumo: MicroRNAs (miRNAs ou miRs) são pequenos RNAs não-codificadores endógenos, de cerca de 23 nucleotídeos, que desempenham importante papel regulatório, a nível pós-transcricional, atuando em inúmeros processos biológicos em animais e plantas. Dentre os inúmeros processos onde os miRNAs atuam, é de importância a modulação da resposta imune inata, área de interesse central nas pesquisas realizadas por nosso grupo. Na interface da interação hospedeiro-patógeno, uma intensa reprogramação da expressão gênica tanto do hospedeiro, como do patógeno é observada, sendo descrito que tais alterações são de grande relevância na resultante da interação. Dentre os genes amplamente descritos como modulados estão os miRNAs do hospedeiro na resposta à infecção por patógenos. Considerando o papel regulatório dos miRNAs, vários estudos mostram sua importância na resposta imune contra bactérias e vírus, mas pouco se sabe sobre seu papel em infecções fúngicas. Paracoccidioides brasiliensis é um fungo dimórfico que causa paracoccidioidomicose, considerada a micose sistêmica mais prevalente no Brasil, e que se faz presente na maioria dos países da América Latina. Dados preliminares de nosso grupo mostraram um maior acúmulo de miRNAs relacionados à resposta imune a P. brasiliensis, especialmente o miR-155. O objetivo deste trabalho é identificar miRNAs diferencialmente modulados na resposta de macrófagos murinos frente à infecção pelo isolado virulento Pb18 de P. brasiliensis. Foram infectados macrófagos primários derivados da medula-óssea (BMDMs) de camundongos de linhagem C57BL/6 com leveduras de P. brasiliensis, e o RNA total foi extraído após os tempos de 30’, 2h, 4h, 6h e 24h de infecção. A quantificação de miRNAs foi realizada por RT-qPCR utilizando o sistema TaqMan miRNA assay. Nesse estudo foram avaliados um conjunto de miRNAs já descritos como importantes na resposta imune a patógenos, tais como miR155 (5p e 3p), miR132, miR146a e miR125b. Os resultados revelam que, apesar de não ter havido modulação dos miRNAs nos tempos iniciais de interação fungo-macrófago, enquanto a partir de 6 e 24 horas de interação observamos um aumento no acúmulo do miR155 (as duas frações -5p e -3p) na célula hospedeira. Os transcritos miR146a e miR125b foram regulados negativamente tanto após 6 quanto após 24 horas de infecção, enquanto em nossos ensaios o miR132 não apresentou modulação em resposta à infecção por P. brasiliensis. Conforme descrito na literatura, o miR155-5p encontra-se relacionado com a indução de uma resposta inflamatória, enquanto os miR146a e miR125b, são descritos como reguladores negativos desta resposta. Em concordância com a resposta imune de BMDMs murinos à infecção por P. brasiliensis descrita na literatura, observamos um aumento de acúmulo de miRs relacionados a uma modulação positiva da resposta inflamatória e uma diminuição do acúmulo de miRs relacionados a uma regulação negativa de tal resposta. Assim, o aumento no acúmulo de miR pró-inflamatório (miR155-5p e -3p) juntamente com a diminuição no acúmulo de miRs anti-inflamatórios (miR146a e miR125b), descrito em BMDMs da linhagem murina C57BL/6 infectados por P. brasiliensis provavelmente resulta na ativação de uma resposta imune inflamatória, descrita como uma resposta protetora contra P. brasiliensis. Visando entender a via de sinalização envolvida na ativação do miR155, foram infectados BMDMs de camundongos deficientes para os receptores Dectina-1, Dectina-2, Toll-Like receptor (TLR) 2 e TLR 4 e foi feita a quantificação dos níveis do miR155-5p após 6 e 24 horas de infecção. Os resultados principais mostram a participação dos TLRs 2 e 4 e Dectina-2 na ativação do miR155-5p. Embora o mecanismo molecular envolvido na sinalização positiva, responsável pela indução da expressão do miR155-5p, não tenha sido abordada nos seus vários níveis, esse trabalho aporta novas informações sobre a base molecular tanto do reconhecimento de P. brasiliensis no modelo in vitro de BMDMs murinos, como também da modulação de importantes efetores regulatórios da resposta imune inata a este patógeno. Em conclusão, este trabalho traz novos dados sobre a modulação de miRNAs em resposta à P. brasiliensis, e sobre as primeiras etapas da via de ativação do miR155 frente à infecção por este patógeno.
Abstract: MicroRNAs (miRNAs or miRs) are endogenous, small non-coding regulatory RNAs, of about 23 nucleotides length, which play an important regulatory role, at posttranscriptional level, acting in a myriad of biological processes in animals and plants. In the context of the research developed by our team, the importance of miRNAs in the modulation of the innate immune response is of our great interest. In the interface of host-pathogen interaction, an intense reprogramming of the gene expression is observed, not only in the host, but also in the pathogen, and this reprogramming is highly relevant to the infection outcome. Among the widely described genes modulated in response to pathogens are the host miRNAs. Several studies have shown their importance in the immune response against viruses and bacteria, but little is known about their role in fungal infections. Paracoccidioides brasiliensis is a dimorphic fungus which causes paracoccidioidomycosis, considered the most prevalent systemic mycosis in Brazil and in almost all countries in Latin America. Preliminary results of our group have showed a higher accumulation of miRNAs related to the immune response to P. brasiliensis, especially miR-155. The main goal of this work is to identify differentially modulated miRNAs in the response of macrophages against infection by virulent isolate Pb18 of P. brasiliensis. Bonemarrow derived macrophages (BMDM) from C57BL/6 mice were infected with yeast forms of P. brasiliensis, and total RNA was extracted after the time intervals of 30 min, 2h, 4h, 6h and 24h of infection. The quantification of miRNAs was performed by RT-qPCR using TaqMan miRNA assay. In this study a group of miRNAs described as having important participation in the immune response against pathogens, like miR155 (5p and 3p), miR132, miR146a and miR125b were evaluated. The results revealed that, despite no modulation was observed in the early time intervals of fungus-macrophage interaction, an increase in the levels of both fractions -5p and - 3p of miR155 was observed in the host cells after 6 and 24 hours of interaction. The transcripts of miR146a and miR125b were both negatively regulated in 6 and 24 hours of infection while, in our assays, miR132 did not show any modulation in response to P. brasiliensis. As described in the literature, miR155-5p is associated to the induction of the inflammatory response, while miR146a and miR125b are described as negative regulators. In agreement to the literature observations with respect to the immune response of murine BMDMs to P. brasiliensis, we observed an increase of miRs accumulation related to a positive modulation of the inflammatory response and a decrease of miRs accumulation related to a negative regulation of this response. Thus, the increase in the accumulation of pro-inflammatory (miR155- 5p and 3p) together with the decrease of anti-inflammatory miRs (miR146a and miR125b), described in BMDMs of C57BL6’s mice infected with P. brasiliensis probably results in the activation of an inflammatory immune response, described as a protective response against P. brasiliensis. In order to understand the signaling pathway involved in the activation of miR155, BMDMs from knockout mice for Toll- Like receptor (TLR) 2, Dectin-2 and TLR 4 were infected and the quantification of miR155-5p was performed after 6 and 24 hours of infection. Main results showed the participation of TLRs 2 and 4, and Dectin-2 in the activation of miR155-5p. Although the molecular mechanism involved in the positive signaling responsible for the induction of miR155 expression has not been fully adressed, this work provides new information on the molecular basis of P. brasiliensis recognition and modulation of important regulatory innate immune response effectors of primary murine macrophages. In conclusion, this work reveals new data on the modulation of miRNAs in response to P. brasiliensis, and on the first step of the activation pathway of miR155 in response to infection by this pathogen.
Informações adicionais: Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Faculdade de Medicina, Programa de Pós-Graduação em Patologia Molecular, 2018.
Licença: A concessão da licença deste item refere-se ao termo de autorização impresso assinado pelo autor com as seguintes condições: Na qualidade de titular dos direitos de autor da publicação, autorizo a Universidade de Brasília e o IBICT a disponibilizar por meio dos sites www.bce.unb.br, www.ibict.br, http://hercules.vtls.com/cgi-bin/ndltd/chameleon?lng=pt&skin=ndltd sem ressarcimento dos direitos autorais, de acordo com a Lei nº 9610/98, o texto integral da obra disponibilizada, conforme permissões assinaladas, para fins de leitura, impressão e/ou download, a título de divulgação da produção científica brasileira, a partir desta data.
Agência financiadora: Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES), Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPQ) e Fundação de Apoio a Pesquisa do Distrito Federal (FAPDF).
Aparece nas coleções:FMD - Mestrado em Patologia Molecular (Dissertações)

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