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Título: Expressão heteróloga de proteínas de C. thermocellum e montagem de celulossomas “in vitro” visando aplicação biotecnológica
Autor(es): Silva, Jéssica Pinheiro
Orientador(es): Noronha, Eliane Ferreira
Assunto: Celulossoma
Biomassa lignocelulósica
Expressão gênica
Data de publicação: 5-Out-2018
Referência: SILVA, Jéssica Pinheiro. Expressão heteróloga de proteínas de C. thermocellum e montagem de celulossomas “in vitro” visando aplicação biotecnológica. 2018. 92 f., il. Dissertação (Mestrado em Biologia Microbiana)—Universidade de Brasília, Brasília, 2018.
Resumo: O presente trabalho tem como objetivo clonar e expressar os genes da endo-xilanase xyn10D, endoglucanase celJ e mini-CipA (contendo dois módulos de coesinas), codificadores de proteínas celulossomais de Clostridium thermocellum para montagem de celulossomas “in vitro”. Os genes endoglucanase celJ e da endo-xilanase xyn10D foram expressos em Pichia pastoris (Komagataella phaffii) da linhagem GS115 sob o controle do promotor induzível AOX1. O clone pPIC9-CelJ/A-1 apresentou atividade de CMCase nas primeiras 24 horas de crescimento, sendo os maiores níveis encontrados após 72 horas. A atividade xilanolítica do clone pPIC9-Xyn10D*-3 também foi detectada nas primeiras 24 horas de cultivo e o maior valor de atividade foi detectado após 96 horas. A endo-xilanase Xyn10D* foi parcialmente purificada após dois passos cromatográficos, troca iônica (QFF) e exclusão molecular (S200) e caracterizada. A Xyn10D* apresentou atividade máxima a 65°C, pH 6,0, e estabilidade térmica a 50°C ,60°C e 70°C. Dos compostos fenólicos avaliados, apenas o ácido tânico inibiu a atividade da enzima. Quanto ao experimento de sacarificação, a Xyn10D* parcialmente purificada, hidrolisou o bagaço de cana de açúcar pré-tratado, mostrando um aumento gradual na liberação de açúcar ao longo do tempo, e a maior quantidade de açúcar redutor foi detectada após 72 horas. O gene da proteína estrutural mini-CipA, foi expresso em Escherichia coli BL21(DE3). Esta proteína foi purificada após dois passos cromatográficos; cromatografia de afinidade e troca iônica (QFF). De acordo com a análise de montagem dos mini-celussomas foi possível notar que em todas as proporções molares testadas de “ΔCipA/Xyn10D* houve associação entre estas proteínas e possivelmente a formação do complexo mini-CipA-Xyn10D*. No entanto, mais experimentos serão necessários para confirmar este resultado. Estudos adicionais sobre a atividade enzimática da Xyn10D* associada a proteína estrutural serão avaliados e comparados com os resultados obtidos com a proteína livre.
Abstract: This work aimed to clone and express the genes of endo-Xylanase xyn10D, endoglucanase celJ and mini-CipA (containing two coesins), encoding cellulosomal proteins of Clostridium thermocellum for assemble of cellulosomes “in vitro”. Endoglucanase celJ and endo-xylanase xyn10D genes were expressed in Pichia pastoris (Komagataella phaffii) of the GS115 strain under the control of the inducible promoter AOX1. Clone pPIC9-CelJ/A-1 showed CMCase activity in the first 24 hours of cultivation, reaching the highest activity after 72 hours. The xylanolytic activity of clone pPIC9-Xyn10D*-3 was also detected during the first 24 hours of cultivation, where the highest levels occurred after 96 hours. The Xyn10D* endo-xylanase was partially purified after two chromatographic steps, ion exchange (QFF) and molecular exclusion (S200) and characterized. The Xyn10D* presented maximum activity at 65 ° C, pH 6.0, and thermostability at 50 ° C, 60 ° C and 70 ° C. Of the phenolic compounds evaluated, only tannic acid inhibited the activity of the enzyme. As for the saccharification experiment, the partially purified Xyn10D * hydrolyzed the pre-treated sugarcane bagasse, showing a gradual increase in sugar release over time, and the highest amount of reducing sugar was detected after 72 hours. The gene encoding the mini-CipA scaffolding protein was expressed in Escherichia coli BL21 (DE3). And this protein was purified after two chromatographic steps, affinity chromatography and ion exchange (QFF). According to analysis of cellulosome assembly, in all molar proportions of "ΔCipA / Xyn10D * tested there was an association between these proteins and possibly the formation of the mini-CipA-Xyn10D * complex. Although more experiments are needed to confirm this result. Additional studies on the enzymatic adivity of Xyn10D* associated with structural protein will be evaluated and compared with the results obtained with the free protein.
Informações adicionais: Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Instituto de Biologia, Pós-Graduação em Biologia Microbiana, 2018.
Licença: A concessão da licença deste item refere-se ao termo de autorização impresso assinado pelo autor com as seguintes condições: Na qualidade de titular dos direitos de autor da publicação, autorizo a Universidade de Brasília e o IBICT a disponibilizar por meio dos sites www.bce.unb.br, www.ibict.br, http://hercules.vtls.com/cgi-bin/ndltd/chameleon?lng=pt&skin=ndltd sem ressarcimento dos direitos autorais, de acordo com a Lei nº 9610/98, o texto integral da obra disponibilizada, conforme permissões assinaladas, para fins de leitura, impressão e/ou download, a título de divulgação da produção científica brasileira, a partir desta data.
Agência financiadora: Conselho Nacional de Desenvolvimento (CNPq); Fundação de Apoio à Pesquisa do Distrito Federal (FAPDF) e Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES).
Aparece nas coleções:IB - Mestrado em Biologia Microbiana (Dissertações)

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