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Título: Proteassoma 20S de Saccharomyces cerevisiae em complexo com o inibidor de serinoproteases BTCI de Vigna unguiculata
Autor(es): Meneghetti, Luisa
Orientador(es): Freitas, Sônia Maria de
Assunto: Proteassoma
Inibidores de serinoproteases
Câncer - tratamento
Data de publicação: 18-Set-2018
Referência: MENEGHETTI, Luisa. Proteassoma 20S de Saccharomyces cerevisiae em complexo com o inibidor de serinoproteases BTCI de Vigna unguiculata. 2018. 98 f., il. Dissertação (Mestrado em Biologia Molecular)—Universidade de Brasília, Brasília, 2018.
Resumo: O proteassoma é um complexo enzimático multicatalítico responsável por processos de degradação proteica e pela manutenção da homeostase celular. A inibição do proteassoma induz a diminuição da progressão de processo tumoral por induzir a apoptose das células cancerígenas. Têm-se caracterizado os inibidores de serinoproteases da família Bowman-Birk como potentes agentes anticancerígenos, sendo parte desse efeito consequência da inibição do proteassoma 20S. O inibidor de tripsina e quimotripsina pertencente à família Bowman-Birk denominado black-eyed pea trypsin/chymotrypsin inhibtor (BTCI), isolado de sementes de Vigna unguiculata, possui ação anticancerígena às células de câncer de mama devido a capacidade de inibir o proteassoma 20S. Neste trabalho, estudos de interação entre o BTCI e o proteassoma, por métodos físico-químicos foram propostos visando caracterizar a estequiometria e os parâmetros termodinâmicos dessa interação. O BTCI foi purificado por cromatografia de troca iônica a partir do extrato bruto de sementes de V. unguiculata. O proteassoma foi obtido da linhagem RJD1144 de Saccharomyces cerevisiae, por cromatografia de afinidade a níquel, seguido de uma cromatografia de troca aniônica. Foram realizados os ensaios de inibição da atividade proteolítica do proteassoma 20S na presença do BTCI, análises de caracterização físico-química e estrutural do BTCI, do proteassoma 20S e do complexo BTCI-proteassoma por ultracentrifugação analítica e ensaios de calorimetria com as duas proteínas, possibilitando mensurar os parâmetros termodinâmicos e a estequiometria da interação do proteassoma 20S com o BTCI. Os valores de Ki obtidos pelos ensaios de inibição a 31 ºC, 34 ºC e 46 ºC foram, respectivamente, iguais a 2,72 ± 0,28 x 10-5 M, 2,97 ± 0.12 x 10-5 M e 1,940 ± 0,004 x 10-6 M. Resultados obtidos por ultracentrifugação analítica sugerem a formação do complexo BTCI-proteassoma 20S com uma estequiometria de 4,2 moléculas de inibidor para cada proteassoma. Para o ensaio de calorimetria realizado a 30ºC, a constante de afinidade obtida foi 1.34 x108 6.42 x107 M-1, e os parâmetros termodinâmicos obtidos foram ΔH, 1.888 x105 1.191 x104 cal/mol, ΔS, 660 cal/mol/deg, e ΔG, -11,1 Kcal.mol-1. A estequiometria estimada por calorimetria foi de 5,3 moléculas de BTCI para cada molécula de proteassoma 20S. Os valores estequiométricos obtidos por calorimetria (ITC) e ultracentrifugação analítica sugerem a ideia da formação do complexo molecular com 4 a 5 moléculas de BTCI para cada proteassoma, sendo formado por processo endotérmico (ΔH>0), entropicamente favorável (ΔS>0) e espontâneo (ΔG<0). A contribuição do fator entrópico (T. S), maior que a variação da entalpia, foi determinante para a espontaneidade da reação.
Abstract: Proteasome is a multicatalytic enzymatic complex responsible for protein degradation and maintenance of cellular homeostasis. Inhibition of proteasome induces a decrease in progression of tumor process by inducing apoptosis of the cancer cells. Bowman-Birk family of serine protease inhibitors have been characterized as potent anticancer agents, part of which is a consequence of inhibition of 20S proteasome. The trypsin and chymotrypsin inhibitor of the Bowman-Birk family called black-eyed pea trypsin / chymotrypsin inhibitor (BTCI), isolated from Vigna unguiculata seeds, has anticancer action on breast cancer cells due proteasome inhibition. In this work, interaction studies between BTCI and proteasome, by physical-chemical methods were proposed aiming to characterize the stoichiometry values and the thermodynamic parameters of this interaction. The BTCI was purified by ion exchange chromatography from the crude extract of V. unguiculata. The proteasome was obtained from the RJD1144 strain of Saccharomyces cerevisiae by nickel affinity chromatography, followed by anion exchange chromatography. Inhibition of proteolytic activity of 20S proteasome in the presence of BTCI, physical-chemical and structural characterization of BTCI, 20S proteasome and BTCI-proteasome complex by analytical ultracentrifugation and calorimetry assays with this proteins were performed to measure the thermodynamic parameters and the stoichiometry of the 20S proteasome interaction with BTCI. The Ki values obtained by the inhibition tests at 31 ° C, 34 ° C and 46 ° C were, respectively, 2.72 ± 0.28 x 10 -5 M, 2.97 ± 0.12 x 10 -5 M and 1.940 ± 0.004 x 10-6 M. Results obtained by analytical ultracentrifugation suggest the formation of the BTCI-proteasome complex with a stoichiometry of 4.2 molecules of BTCI for each molecule of proteasome. In calorimetry test performed at 30 ° C, the affinity constant obtained was 1.34 x108 ± 6.42 x107 M-1, and the thermodynamic parameters obtained were ΔH, 1,888 x105 ± 1,191 x104 cal / mol, ΔS, 660 cal / mol / K, and ΔG, -11.1 Kcal.mol-1. Stoichiometry estimated by calorimetry was 5.3 molecules of BTCI for each proteasome molecule. The stoichiometric values obtained by calorimetry (ITC) and analytical ultracentrifugation suggest the formation idea of a molecular complex with 4 or 5 BTCI molecules for each proteasome, being formed by endothermic (ΔH> 0), entropically favorable (ΔS> 0) and spontaneous (ΔG <0) process. The contribution of the entropic factor (T. ΔS), higher than the enthalpy variation, was determinant for the spontaneity of reaction.
Informações adicionais: Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Departamento de Biologia Celular, Programa de Pós-Graduação em Biologia Molecular, 2018.
Licença: A concessão da licença deste item refere-se ao termo de autorização impresso assinado pelo autor com as seguintes condições: Na qualidade de titular dos direitos de autor da publicação, autorizo a Universidade de Brasília e o IBICT a disponibilizar por meio dos sites www.bce.unb.br, www.ibict.br, http://hercules.vtls.com/cgi-bin/ndltd/chameleon?lng=pt&skin=ndltd sem ressarcimento dos direitos autorais, de acordo com a Lei nº 9610/98, o texto integral da obra disponibilizada, conforme permissões assinaladas, para fins de leitura, impressão e/ou download, a título de divulgação da produção científica brasileira, a partir desta data.
Agência financiadora: Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq); Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) e Fundação de Apoio à Pesquisa do Distrito Federal (FAP-DF).
Aparece nas coleções:CEL - Mestrado em Biologia Molecular (Dissertações)

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