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Título: Caracterização de fatores que afetam a detecção de presas através do sequenciamento de alto desempenho do DNA
Outros títulos: Characterization of factors that affect prey detection through massively parallel DNA sequencing of predator gut contents
Autor(es): Timbó, Renata Velôzo
Orientador(es): Paula, Débora Pires
Coorientador(es): Togawa, Roberto Coiti
Assunto: Controle biológico
Inseto
DNA
Pragas agrícolas
Data de publicação: 21-Nov-2017
Referência: TIMBÓ, Renata Velôzo. Caracterização de fatores que afetam a detecção de presas através do sequenciamento de alto desempenho do DNA. 2017. vii, 202 f., il. Tese (Doutorado em Biologia Molecular)—Universidade de Brasília, Brasília, 2017.
Resumo: A identificação de presas consumidas por predadores constitui-se em importante área da Ecologia por possibilitar o estudo das interações intra e interespecíficas em um ecossistema. Esse conhecimento ajuda a avaliar seu funcionamento e como as interações mudam em resposta ao ambiente. Para muitos estudos de predação o ideal é determinar a biodiversidade de presas consumidas por um dado predador a campo, o que ainda não tem sido satisfatoriamente alcançado pelos métodos em voga de detecção de presas devido a limitações diversas. Muitos deles não conferem resolução taxonômica desejável, ou são dependentes do conhecimento prévio das espécies predadas para ser possível detectá-las através do uso de marcadores específicos, ou se baseiam no uso de PCR, o que é limitado à eficiência dos primers utilizados. Este trabalho visou avaliar a meia-vida de detecção, a sensibilidade (número mínimo de presa detectável), a especificidade (resolução taxonômica) e a variabilidade do método de sequenciamento de alto desempenho do DNA do conteúdo gastrointestinal de predadores para identificação de presas consumidas, o qual teoricamente tem potencial para detectar a biodiversidade de presas consumidas. Nesse método, não há etapa intermediária de amplificação de regiões barcodes das presas. As presas são prontamente identificadas através da detecção de fragmentos de seus DNA mitocondriais sequenciados, graças ao uso de banco de referência de DNA mitocondrial de várias espécies, incluindo aquelas com potencial de serem presas do predador em estudo. Adicionalmente, avaliou-se a relação de dependência da detecção da presa em função: das espécies de presapredador em interação; da fase do ciclo de vida do predador; do seu modo de alimentação; do número de presas predadas; da predação ser primária ou secundária; da temperatura de digestão; do número de unidades experimentais (indivíduo-predador) utilizado por biblioteca de DNA; do tamanho do inserto (550 e 350 pb) utilizado nas bibliotecas. Quatro bioensaios de alimentação foram realizados utilizando como presas as espécies Myzus persicae, Bemisia tabaci, Spodoptera frugiperda, importantes pragas agrícolas, e como predadores Cycloneda sanguinea, Harmonia axyridis, Hippodamia convergens, Chrysoperla externa, importantes inimigos naturais de pragas agrícolas. Após controle de qualidade dos dados de sequenciamento e de análises de bioinformática (pipelines customizados) constatou-se que: houve detecção da ingestão de uma unidade experimental da presa pelo menos imediatamente após predação; houve detecção das presas com alta resolução taxonômica (nível de espécie), porém houve também detecção de falsos-positivos na maioria das bibliotecas e de falsonegativo nas bibliotecas de B. tabaci; o tempo pós-predação, as espécies de presa-predador em interação e a forma de alimentação do predador afetaram a detecção da presa; o período de detectabilidade variou em função das espécies de presa-predador em interação; houve detecção de predação secundária. Por outro lado, a temperatura de digestão da presa e o número de presas consumidas não afetaram a detecção da presa, no entanto quanto maior o número de presas consumidas maior foi o período de detectabilidade. Portanto, esse método é adequado para identificar a biodiversidade de predadores amostrados a campo, no entanto, devido a possibilidade de detecção de falsos positivos, recomenda-se confirmar o consumo de cada espécie detectada através de método complementar espécie-específico. Adicionalmente, recomenda-se também sempre usar controle negativo (predador sem alimentação) para verificação de potenciais falsos positivos.
Abstract: Identification of prey species is an important area of ecology because it enables the study of intra- and inter- specific interactions in an ecosystem. This knowledge supports the evaluation of ecosystem functioning and how species interactions change in response to the environment. For many field predation studies an ideal situation would be to determine the biodiversity of prey consumed by a given predator, which has not yet been satisfactorily achieved by prevailing methods of prey detection due to diverse limitations. Many of the prevailing methods do not confer desirable taxonomic resolution; or they are dependent on prior knowledge of the prey species to be able to detect them with specific markers; or they are based on PCR, which is limited by primer efficiency. This work aimed to evaluate the detectability half-life, sensitivity (minimum number of detectable prey), specificity (taxonomic resolution) and variability of prey detection (number of reads) using massively parallel DNA sequencing of the predator gut contents. This theoretically has the potential to detect the biodiversity of prey consumed. In this method, there is no intermediate stage of amplification of prey DNA barcodes by PCR. Prey are readily identified by detection of fragments of their mitochondrial DNA sequences, which are matched to a reference mitochondrial DNA database of species, including those likely to be preyed upon by the predator(s) under investigation. In addition, this study evaluated the dependence of prey detection as a function of: prey-predator species in interaction; predator stage; feeding mode; number of prey; primary or secondary predation; environmental temperature of prey digestion; number of experimental units (individual-predator) used per DNA library; insert size (350 and 550 bp) used in the libraries. Four feeding bioassays were performed using as prey species: Myzus persicae, Bemisia tabaci, and Spodoptera frugiperda, which are all important pests, and as predators: Cycloneda sanguinea, Harmonia axyridis, Hippodamia convergens, and Chrysoperla externa, which are important natural enemies of pests. After quality control of the sequencing data and bioinformatic analyses (using customized pipelines), the following were found: one prey individual can be detected, at least immediately after predation; false positives were detected in the majority of the libraries and B. tabaci was not detected in any of the libraries of the predator that fed on it (the sole false-negative case); elapsed time after consumption, prey-predator species in interaction and predator feeding mode affected prey detection; detectability period varied according to the prey-predator species in interaction; secondary predation was detected, although there was no discrimination of primary versus secondary predation without prior knowledge of the history of the predation events. On the other hand, temperature of prey digestion and number of prey consumed did not affect prey detection, although higher was the number of prey consumed, the longer was the detectability period. Therefore, this method is suitable to identify biodiversity of prey consumed by fieldsampled predators. However, due to the possibility of detection of false positives, it is recommended to validate prey consumption using a complementary species-specific detection method (e.g., PCR). In addition, it is also recommended to include a library for negative control (predator in starvation) to check for the potential of false positives.
Informações adicionais: Tese (doutorado)—Universidade de Brasília, Departamento de Biologia Celular, Instituto de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Biologia Molecular, 2017.
Licença: A concessão da licença deste item refere-se ao termo de autorização impresso assinado pelo autor com as seguintes condições:Na qualidade de titular dos direitos de autor da publicação, autorizo a Universidade de Brasília e o IBICT a disponibilizar por meio dos sites www.bce.unb.br, www.ibict.br, http://hercules.vtls.com/cgi-bin/ndltd/chameleon?lng=pt&skin=ndltd sem ressarcimento dos direitos autorais, de acordo com a Lei nº 9610/98, o texto integral da obra disponibilizada, conforme permissões assinaladas, para fins de leitura, impressão e/ou download, a título de divulgação da produção científica brasileira, a partir desta data.
Aparece nas coleções:CEL - Doutorado em Biologia Molecular (Teses)

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