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Título: Avaliação de proteínas do processamento de microRNA de vesículas extracelulares provenientes de linhagens celulares tumorais
Autor(es): Carmo, Natalia Gurgel do
Orientador(es): Pereira, Rinaldo Wellerson
Assunto: Células cancerosas
Vesículas extracelulares
MicroRNA
Mamas - câncer
Data de publicação: 31-Ago-2017
Data de defesa: 19-Jun-2017
Citação: CARMO, Natalia Gurgel do. Avaliação de proteínas do processamento de microRNA de vesículas extracelulares provenientes de linhagens celulares tumorais. 2017. 85f., il. Tese (Doutorado em Patologia Molecular)—Universidade de Brasília, Brasília, 2017.
Resumo: Exossomos e microvesículas fazem parte das vesículas extracelulares. Estas são produzidas e liberadas por uma variedade de tipos celulares, inclusive em sobrenadante do meio celular, e estão presentes em diferentes fluidos biológicos. Elas podem carregar mRNA e miRNA, dentre outras moléculas. No câncer, os miRNA associados às vesículas extracelulares estão relacionados com a comunicação entre as células tumorais e o microambiente tumoral. Este estudo avaliou a presença das proteínas relacionadas com a maquinaria de processamento de miRNA, nas vesículas extracelulares secretadas pelas linhagens celulares MDA-MB231 (câncer de mama humano) e fibroblasto humano no tempo de crescimento celular de 72 horas. Para purificar estas partículas foi utilizado o método de centrifugação diferencial e ultracentrifugação. Após isto, caracterizou-se as vesículas pelo seu tamanho e distribuição de partículas utilizando a resistência de pulso, pelo sistema qNANO. Para a detecção de proteínas, a técnica de western blot foi realizada a fim de se identificar a presença das proteínas de interesse. Como resultado, as vesículas extracelulares provenientes dos sobrenadantes das linhagens celulares foram purificadas e caracterizadas pelo seu tamanho adequadamente. Observou-se também que a quantidade de partículas de vesículas extracelulares da linhagem tumoral obtida pelo sistema qNANO, foi superior quando comparada à amostra não-tumoral. Os resultados da detecção de proteínas por western blot demonstram que as proteínas Dicer, Ago2 e TRBP2 estão presentes na amostra proveniente da linhagem tumoral MDA-MB231. Confirmou-se a presença de proteínas TSG101, Alix, CD63 - marcadoras moleculares de vesículas extracelulares. Confirmou-se também ausência nas amostras, da proteína Calnexina, a qual é controle negativo e é indicativo de contaminação nas vesículas extracelulares. Por fim, foram identificadas em ambas as amostras as proteínas ApoA-IV, AQP2 e IL-6, as quais estão associadas ao microambiente tumoral na sinalização do miRNA. Conclui-se que as proteínas Dicer, Ago2 e TRBP2, pertencentes a maquinaria de processamento de miRNA, bem como proteínas ainda não discutidas pela literatura em vesículas extracelulares na linhagem tumoral estudada, estão presentes no sobrenadante da linhagem tumoral MDA-MB231, sugerindo um papel para essas moléculas na biologia tumoral.
Abstract: Exossomes and microvesicles are part of the extracellular vesicles. There are produced and released by a variety of cell types, including cell media supernatant, and be present in different biological fluids. They can carry mRNA and miRNA, among other molecules. In cancer, miRNAs associated with extracellular vesicles are related to the communication between tumor cells and the tumor microenvironment. This study evaluated the presence of proteins related to the miRNA processing machinery in the extracellular vesicles secreted by cell lines MDA-MB231 (human breast cancer) and human fibroblast at cell growth time of 72 hours. Purification of the culture medium supernatant was carried out by the differential ultracentrifugation method. After this, the vesicles were characterized by their size and particle distribution using the pulse resistance by qNANO system. For the detection of proteins, the western blot technique was performed to identify the presence of the proteins of interest. As a result, extracellular vesicles from cell line supernatants were purified and characterized by their size appropriately. It was also observed that the number of extracellular vesicles particles of the tumor lineage obtained by qNANO system was superior when compared to the nontumor sample. The results of western blot detection of proteins demonstrate that Dicer, Ago2 and TRBP2 proteins, related to miRNA processing machinery, are present in the sample from the MDA-MB231 tumor line. We confirmed the presence of TSG101, Alix, CD9 – which are extracellular vesicle molecular marker proteins. Also, we confirmed in both samples the absence of Calnexin, which is a negative control, it is indicative of contamination in the extracellular vesicles. Lastly, we identified in both samples ApoAIV, AQP2 and IL-6 proteins which are associated with tumor microenvironment in miRNA signaling. In conclusion, Dicer, Ago2 and TRBP2 proteins belonging to miRNA processing machinery, as well as proteins not yet discussed in the literature in extracellular vesicles from tumor cell, were present in the supernatant of the MDAMB231 tumor cell, suggesting a role for these molecules in tumor biology.
Descrição: Tese (doutorado)—Universidade de Brasília, Faculdade de Medicina, Programa de Pós-Graduação em Patologia Molecular, 2017.
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