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Título: Análise comparativa de complexos multienzimáticos do secretoma de Trichoderma harzianum cultivado em bagaço de cana e fontes definidas de carbono
Autor(es): Mojana di Cologna, Nicholas de
Assunto: Cana-de-açúcar
Biodiesel - qualidade
Eletroforese
Espectrometria de massa
Análise proteômica
Carbono
Data de publicação: 21-Jun-2017
Referência: MOJANA DI COLOGNA, Nicholas de. Análise comparativa de complexos multienzimáticos do secretoma de Trichoderma harzianum cultivado em bagaço de cana e fontes definidas de carbono. 2017. 113 f., il. Dissertação (Mestrado em Biologia Molecular)—Universidade de Brasília, Brasília, 2017.
Resumo: O bioetanol, fonte de energia renovável, é produzido principalmente por meio da fermentação da sacarose produzida por vegetais. No entanto, os polissacarídeos presentes nos resíduos lignocelulósicos ainda contém grande quantidade de energia armazenada. Esses resíduos são considerados recalcitrantes, por serem de difícil acesso para as enzimas hidrolíticas. Ao longo da evolução, muitos microrganismos adquiriram a capacidade de mobilizar a matéria e a energia armazenadas nesse material, com um diversificado arsenal de enzimas hidrolíticas. Os fungos filamentosos se destacam dentre esses microrganismos, como por exemplo os do gênero Trichoderma. Estudos anteriores do grupo mostraram que a cepa T4 do fungo T. harzianum, quando cultivado em bagaço de cana, tem proteínas organizadas em complexos multienzimáticos no seu secretoma. O presente estudo visou verificar se fontes definidas de carbono presentes no bagaço de cana (celulose e xilana) seriam capazes de induzir individualmente a produção de complexos multienzimáticos, se sua composição seria a mesma dos observados em bagaço de cana ou depende da fonte de carbono e se esses complexos seriam compostos por enzimas capazes de hidrolisar várias fontes de carbono. Os fungos foram cultivados em meio sólido e posteriormente inoculados em meio líquido contendo as fontes de carbono. Após nove dias, os secretomas foram filtrados, dialisados, concentrados e submetidos a SDS-PAGE, 1D-BN-PAGE e 2D-BN/SDS-PAGE. Os resultados das análises eletroforéticas mostraram várias diferenças entre os secretomas dos diferentes tipos de meio de cultivo. No 2D-BN/SDS-PAGE, comprovou-se a presença de complexos devido à decomposição das bandas da primeira dimensão em diversos spots na segunda dimensão. A identificação por LC-MS/MS das bandas de 1D-BN-PAGE revelou a presença de complexos putativos. As proteínas identificadas com maior confiança foram discutidas, sendo que 23,7% delas eram comuns às três fontes de carbono. Essas proteínas eram todas Enzimas Ativas em Carboidratos (CAZimas), exceto uma proteína de Indução de Resistência Local e Sistêmica (ISR), a Epl1. A composição dos complexos se mostrou dependente das fontes de carbono. A presença de proteínas como a “Glycosyl hydrolase family 3 N terminal domain-containing protein” em quase todas as bandas de celulose e xilana, a aldose-1-epimerase em todas as bandas de xilana e duas bandas do bagaço, a feruloil esterase B somente em bandas de bagaço de cana e a proteína Epl1 em complexos de todos os tipos levanta hipóteses para a presença de proteínas organizadoras de complexos, talvez com função análoga à das escafoldina nos celulossomas. Caracterizações mais precisas dos complexos, incluindo de atividade enzimática, composição, padrões de interação e estruturas estão entre as perspectivas do trabalho. Para permitir isso, técnicas de purificação de complexos já estão em processo de implementação no laboratório, para etapas subsequentes do projeto.
Abstract: Bioethanol, a renewable energy source, is produced mainly through the fermentation of plant sucrose. However, the polysaccharides present on the lignocellulosic residues still contains a high amount of stored energy. These residues are considered recalcitrant, because they are not easily accessed by hydrolytic enzymes. Throughout the evolution, many microorganisms developed the ability to mobilize the matter and energy stored in this material, with a diversified arsenal of hydrolytic enzymes. Filamentous fungi are a highlight among these microorganisms, for example those of the Trichoderma genus. Previous studies from our group have shown that the fungus T. harzianum strain T4, when grown on sugarcane bagasse, has proteins organizes in multienzyme complexes in its secretome. The present study aimed to verify if defined carbon sources present on the sugarcane bagasse (cellulose and xylan) would be able to induce individually the production of multienzyme complexes, if their composition would be the same as what was previously observed on sugarcane bagasse or carbon source-dependent, and if these complexes would be composed of enzymes able to hydrolyze different carbon sources. The fungi were grown on solid medium and after inoculated on liquid media containing the carbon sources. After nine days, the secretomes were filtered, dialyzed, concentrated and submitted to SDS-PAGE, 1D-BN-PAGE and 2D-BN/SDS-PAGE. The electrophoretic analysis results have shown several differences between the secretomes on the different growth media. On the 2D-BN/SDS-PAGE, the presence of complexes was confirmed due to the decomposition of the first dimension bands into several spots on the second dimension. Identification by means of LC-MS/MS of 1D-BNPAGE bands has revealed the presence of several putative complexes. The most reliably identified proteins were discussed, 23.7% of them being common to all three carbon sources. These proteins were all Carbohydrate-Active Enzymes (CAZymes), except for an Induced Systemic Resistance (ISR) protein, Epl1. The complexes’ composition was shown to be carbon source-dependent. The presence of proteins such as the Glycosyl hydrolase family 3 N terminal domain-containing protein on almost all cellulose and xylan bands, aldose-1-epimerase on all xylan bands and two sugarcane bagasse bands, feruloyl esterase B only on sugarcane bagasse bands and the Epl1 protein on complexes of all kinds raises hypothesis for the presence of complex-organizing proteins, maybe with an analogous function to the cellulosome scaffoldin protein. More precise characterizations, including enzymatic activity, composition, interaction patterns and structure are among this work’s perspectives. For that purpose, purification techniques for complexes are already being implemented on the laboratory, for subsequent steps of this project.
Informações adicionais: Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Instituto de Ciências Biológicas, Departamento de Biologia Celular, Programa de Pós-Graduação em Biologia Molecular, 2017.
Licença: A concessão da licença deste item refere-se ao termo de autorização impresso assinado pelo autor com as seguintes condições: Na qualidade de titular dos direitos de autor da publicação, autorizo a Universidade de Brasília e o IBICT a disponibilizar por meio dos sites www.bce.unb.br, www.ibict.br, http://hercules.vtls.com/cgi-bin/ndltd/chameleon?lng=pt&skin=ndltd sem ressarcimento dos direitos autorais, de acordo com a Lei nº 9610/98, o texto integral da obra disponibilizada, conforme permissões assinaladas, para fins de leitura, impressão e/ou download, a título de divulgação da produção científica brasileira, a partir desta data.
Agência financiadora: Esta dissertação foi desenvolvida com o apoio financeiro do Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq).
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