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Título: Caracterização parcial de mananases produzidas por Clonostachys byssicola cultivado em casca de soja
Autor(es): Costa, Diandra Albuquerque Lopes
Orientador(es): Ferreira Filho, Edivaldo Ximenes
Assunto: Soja
Enzimas de fungos
Data de publicação: 18-Abr-2017
Data de defesa: 17-Fev-2017
Citação: COSTA, Diandra Albuquerque Lopes. Caracterização parcial de mananases produzidas por Clonostachys byssicola cultivado em casca de soja. 2017. vi, 70 f., il. Dissertação (Mestrado em Biologia Microbiana)—Universidade de Brasília, Brasília, 2017.
Resumo: As mananases microbianas são principalmente enzimas extracelulares, cuja produção é grandemente influenciada por fatores nutricionais e fisioquímicos, como fonte de nitrogênio, carbono, pH, temperatura, agitação e concentração de oxigênio dissolvido. Dada a propriedade de atuar em uma ampla faixa de pH e temperatura, as mananases microbianas apresentam uma variedade de aplicações, podendo ser empregadas na produção de etanol de segunda geração, indústrias têxteis, como também no melhoramento do valor nutricional de alguns alimentos. Neste trabalho, o fungo filamentoso Clonostachys byssicola foi utilizado para produção de mananases tendo a casca de soja como fonte de carbono. C. byssicola, foi cultivado em meio submerso contendo casca de soja 1% por sete dias. O extrato bruto, concentrado por ultrafiltração (EBC) com membrana de retenção de 30 kDa, apresentou atividade de mananase de 4,18 UI/mL. As amostras de mananases presentes no EBC foram semi-purificadas por dois tipos de cromatografia de troca aniônica: DEAE Sepharose Fast Flow (DEAE) e Q Sepharose Fast Flow (QFF). O EBC e a fração semi-purificada (ManQFF) apresentaram temperaturas com maior atividade à 55 e 45 ºC, respectivamente. Ambas as amostras enzimáticas foram mais ativas em pH 5,0. As amostras enzimáticas do EBC e ManQFF apresentaram termoestabilidade a 40ºC por um período de 192 horas e 50 min, respectivamente. O íon Co2+ aumentou as atividades de mananases do EBC (15%) e ManQFF (35%) quando incubado em uma concentração final de 10 mM. Contudo, os compostos fenólicos inibiram a atividade de mananase. A atividade de mananase do EBC apresentou um KM aparente de 12,73 ± 1,97 mg/mL e Vmáx de 7,65 ± 0,52 UI/mL, enquanto a presente na fração semi-purificada exibiu KM de 8,53 ± 0,31 mg/mL e Vmáx de 0,255 ± 0,0033 UI/Ml. A análise da eletroforese e zimografia, mostrou que C. byssicola produz proteoformas de mananases com massas moleculares variando de 36,6 a 53 kDa. Ademais, os ensaios de hidrólise enzimática da manana 1% e da casca de soja 1% com amostras do EBC, mostraram a produção de grandes quantidades de mano-oligossacarídeos, cujos principais produtos liberados foram manose e manobiose.
Abstract: Microbial mannanases are mainly extracellular enzymes whose production is greatly influenced by nutritional and physicochemical factors such as nitrogen and carbon sources, pH, temperature, agitation and dissolved oxygen concentration. Given the property of acting in a wide range of pH and temperature, the microbial manannases present a variety of applications, being able to be used in the production of second generation ethanol, textile industries, as well in improving the nutritional value of some foods. In this work, the filamentous fungus Clonostachys byssicola was used to produce mannanases having the soybean hull 1% as carbon source C. byssicola, was cultivated in submerged medium containing soybean hull for seven days. The crude extract was concentrated by ultrafiltration (EBC) membrane with retention of 30 kDa and presented mananase activity of 4.18 IU/mL. The mannanase samples present in the EBC were semi-purified by two types of anion exchange chromatography: DEAE Sepharose Fast Flow (DEAE) and Q Sepharose Fast Flow (QFF). Both, EBC and semi-purified fraction (ManQFF) were more active at 55 and 45 ºC, respectively. Both enzymatic samples were also more active at pH 5.0. Regarding their thermostability, EBC and ManQFF enzymatic samples showed half-lives of 192 hours and 50 min at 40°C, respectively. The Co2+ ion increased mannanase activities of EBC (15%) and ManQFF (35%) when incubated at a final concentration of 10 mM. However, phenolic compounds inhibited the activity of mannanase. EBC mannanase activity had an apparent KM of 12.73 ± 1.97 mg/mL and Vmax of 7.65 ± 0.52 IU/mL, whereas the semi-purified fraction exhibited KM of 8.53 ± 0.31 mg / mL and Vmax of 0.255 ± 0.0033 IU/mL. Electrophoresis and zymogram studies showed that C. byssicola produces proteoforms of mannanases with molecular mass varying from 36.6 to 53 kDa. In addition, enzymatic hydrolysis experiments of mannan 1% and soybean hulls 1% with EBC samples showed the production of large quantities of mannooligosaccharides, mannobiose and mannose.
Descrição: Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Instituto de Biologia, Pós-Graduação em Biologia Microbiana, 2017.
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