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Título: Produção heteróloga de ácido hialurônico em Klyuveromyces lactis
Autor(es): Gomes, Antonio Milton Vieira
Orientador(es): Parachin, Nádia Skorupa
Assunto: Leveduras - melhoramento genético
Engenharia metabólica
Ácido hialurônico
Biopolímeros
Data de publicação: 17-Abr-2017
Referência: GOMES, Antonio Milton Vieira. Produção heteróloga de ácido hialurônico em Klyuveromyces lactis. 2016. vii, 85 f., il. Dissertação (Mestrado em Biologia Molecular)—Universidade de Brasília, Brasília, 2016.
Resumo: O ácido hialurônico (AH) é um biopolímero composto de repetições alternadas dos monossacarídeos Ácido Glucurônico e N-Acetil glucosamina, sendo presente em todos os vertebrados e em humanos principalmente na pele. O AH possui aspecto viscoso, ajuda no rejuvenescimento da pele quando aplicado em humanos e é uma molécula considerada segura na utilização em animais em geral, por estes motivos o AH é muito utilizado na indústria farmacêutica e médica. Atualmente o AH é produzido por bactérias, que em diferentes níveis, são patogênicas aos animais, o que dificulta o escalonamento desta tecnologia e eleva os custos de purificação o que torna o AH uma molécula de alto custo financeiro. Leveduras não são capazes de sintetizar AH, mas são fábricas perfeitas para a sua produção, uma vez que são consideradas seguras, mais adaptadas às condições industriais quando comparado a bactérias e possuem parcialmente a via da síntese do ácido AH, sendo capazes de sintetizar um de seus precursores, o açúcar N-Acetil Glucosamina. As enzimas HAS (Hyaluronic Acid Synthases) que sintetizam AH são proteínas que se acoplam à membrana das células formando novas cadeias de AH pela junção dos dois açúcares precursores. Todos os vertebrados possuem HAS semelhantes e classificadas como Classe I, enquanto que a bactéria patogênica Pasteurella multocida, possui uma HAS diferente classificada como classe II. A fim de observar o possível impacto na síntese de AH devido às diferenças entre HAS de classe I de classe II, estes foram inseridos na levedura Klyveromyces lactis concomitante com o gene hasB (UDP-Glicose Desidrogenase). Com o auxílio de um estudo que testou a eficiência de transformação de K. lactis por metodologias de choque térmico e de eletroporação, foram construídas 4 cepas recombinantes de K. lactis contendo as diferentes formas de HAS de modo a aumentar a produção de AH pela levedura. Após a construção das cepas recombinantes, um meio otimizado baseado nas necessidades de co-fatores e metabólitos principais utilizados na via de síntese de AH foi desenvolvido e utilizado nas cinéticas de crescimento de K. lactis. Também testada, a influência das fontes de carbono glicose, sacarose, lactose e galactose foram visualizadas durante o crescimento nas cepas produtoras de AH, uma vez que diferentes fontes de carbono afetam de maneira diferente a glicólise e consequentemente o metabolismo de AH na célula. Lactose e sacarose aumentaram a produção de AH nas células em relação a galactose e glicose devido a um abastecimento mútuo da via de síntese dos dois precursores do AH. Utilizando lactose como fonte de carbono, foi alcançada uma melhor produção de 0,39 g/L de AH, valor competitivo com os alcançados por outra única levedura produtora de AH, o que prova pela primeira vez que K. lactis é uma potencial candidata para otimização da produção deste biopolímero.
Abstract: Hyaluronic acid (HA) is a biopolymer composed of alternating repeats of monosaccharides Glucuronic Acid and N-Acetyl glucosamine, being present in all vertebrates and humans mainly in the skin. The HA has a viscous appearance, is used in skin rejuvenation when applied in humans and is a safe molecule for application in animals in general, for these reasons HA is widely used in the pharmaceutical and medical industry. Currently, HA is produced by bacteria pathogenic to humans, and are difficult to scale due to technology and purification costs. Yeasts are perfect factories for HA production, since they are considered safe, more adapted to industrial conditions when compared to bacteria and have partially complete the synthesis route of HA, being able to synthesize one precursor, the UDP-N-Acetyl Glucosamine. HA is produced by HAS (Hyaluronic Acid Synthase) enzymes. HAS enzymes have transmembrane domains that couple to the membrane of the cells forming new chains of HA by the junction of the two precursor sugars located in the cytoplasm. All vertebrates have HAS classified as Class I, whereas the pathogenic bacterium Pasteurella multocida have a different HAS (pmHAS) classified as Class II. To observe the impact on HA synthesis due to the differences between Class I and Class II HAS, in this study the hasA genes were inserted into yeast Klyveromyces lactis concomitant with the hasB gene (UDP-Glucose Dehydrogenase). A total of 4 recombinant strains of K. lactis containing different isoforms of HAS were constructed to increase a production of HA by yeast. After the construction of the recombinant strains, an optimized medium to auxiliary the needs of cofactors and metabolites was used in the synthesis pathway of HA for the development and use of K. lactis in fermentations. Also tested, the influence of the sources of carbon glucose, sucrose, lactose and galactose were visualized in fermentation in the HA producing strains, since different carbon sources affect glycolysis differently and consequently the metabolism of HA in the cell. Lactose and sucrose increased HA production in cells relative to galactose and glucose due to a mutual supply of the synthesis pathway of the two HA precursors. Using lactose as a carbon source, it obtained a better yield of 0.39 g / L of HA, a competitive value with the finished results of another single HA -producing yeast, which proves for the first time that K. lactis is a potential candidate for optimization of the production of this biopolymer.
Informações adicionais: Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Instituto de Ciências Biológicas, Departamento de Biologia Celular, Programa de Pós-Graduação em Biologia Molecular, 2016.
Licença: A concessão da licença deste item refere-se ao termo de autorização impresso assinado pelo autor com as seguintes condições: Na qualidade de titular dos direitos de autor da publicação, autorizo a Universidade de Brasília e o IBICT a disponibilizar por meio dos sites www.bce.unb.br, www.ibict.br, http://hercules.vtls.com/cgi-bin/ndltd/chameleon?lng=pt&skin=ndltd sem ressarcimento dos direitos autorais, de acordo com a Lei nº 9610/98, o texto integral da obra disponibilizada, conforme permissões assinaladas, para fins de leitura, impressão e/ou download, a título de divulgação da produção científica brasileira, a partir desta data.
DOI: http://dx.doi.org/10.26512/2015.04.D.23298
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