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Title: Análise preliminar do transcriptoma de células dendríticas humanas após infecção por Trypanosoma cruzi
Authors: Jaramillo, Natalia Gil
Orientador(es):: Santana, Jaime Martins de
Assunto:: Trypanosoma cruzi
Chagas, Doença de
Resposta imunológica
Células dendríticas
Issue Date: 17-Oct-2016
Data de defesa:: 4-Jul-2016
Citation: JARAMILLO, Natalia Gil. Análise preliminar do transcriptoma de células dendríticas humanas após infecção por Trypanosoma cruzi. 2016. xiii, 126 f., il. Dissertação (Mestrado em Ciências Médicas)—Universidade de Brasília, Brasília, 2016.
Abstract: As células dendríticas (DCs) são um dos mais importantes componentes do sistema imunológico e desempenham funções essenciais como reconhecimento do antígeno no local da infecção bem como sua internalização e apresentação de forma eficiente. Estas células tem papel central na ligação das respostas imunes naturais e adquiridas contra Trypanosoma cruzi, o agente causador da doença de Chagas. As DCs podem modular a resposta imunológica do hospedeiro, dependendo da sua subpopulação, do seu nível de maturação, das citocinas presentes no meio e do receptor dessas células envolvido nas interações com o T. cruzi, influenciando o desenvolvimento das formas clínicas da doença. Dentro desde contexto, esta dissertação apresenta a padronização da obtenção de DCs provenientes de monócitos de três doadores voluntários e otimização da diferenciação da forma tripomastigota metacíclica (TM) do parasito in vitro para posterior interação entre ambas as células e extração do RNA total para sequenciamento e montagem do transcriptoma por duplicata. Entre as cepas G e CL Brener de T. cruzi, a 2ª mostrou um melhor rendimento no que diz respeito a velocidade de crescimento em cultura, porcentagens finais de metaciclogênese e taxa de infecção. Durante a obtenção e diferenciação das DCs, três técnicas foram aplicadas para confirmação, incluindo citometria de fluxo, visualização em microscópio óptico e de fluorescência. O tempo estabelecido para interação parasito-célula hospedeira foi de 12 h, depois de transcorrido esse tempo obteve-se 39% de taxa de infecção, média de 2,4 amastigotas/DC infectada e 80% de DCs infectadas ativadas contra 47% das células controle. O passo seguinte foi a extração do RNA total das amostras controle e infectadas para sequenciamento e a montagem dos reads. Os resultados provenientes deste processo mostram ser confiáveis devido à cobertura satisfatória dos reads dentro do genoma humano com ~23.000.000 reads por amostra, e ao coeficiente de correlação próximo a 1 entre as duplicatas, fortes indícios da qualidade dos dados. A obtenção de uma visão detalhada da biologia das células apresentadoras de antígenos após os contatos iniciais com T. cruzi poderá proporcionar novos alvos para o tratamento da doença e ajudará no entendimento da evolução diferencial da doença nos pacientes e nos mecanismos de resistência e tolerância ao T. cruzi.
Abstract: Dendritic cells (DCs) are one of the most important components of human immunologic system and are able to develop essential functions like antigen recognition at the infection site and its internalization and presentation are accomplished with high efficiency. These cells play a central role in linking natural and acquired immune response against Trypanosoma cruzi, the etiologic agent of Chagas disease. DCs can modulate host immunologic response depending on their subset, maturation level, cytokine milieu and DC receptor involved in the interactions with T. cruzi, influencing the development of the disease clinic forms. Therefore, this dissertation presents the standardization of DCs derived from monocyte obtained from three voluntaries and the optimization of in vitro metacyclic trypomastigote form differentiation to proceed to interaction between both cells and subsequently total RNA extraction for sequencing and transcriptome assembly. Among G and CL Brener T. cruzi strains, the second yielded more with respect to culture grow velocity, final metacyclogenesis percentages and infection rate. During DCs obtainment and differentiation, three technics were applied to confirmation, including flow cytometry and optic or fluorescence microscopy visualization. A parasite-host cell interaction time of 12 h was established and after it, infection rates of about 39%, an average of 2.4 amastigotes/infected DC were obtained and also 80% of DCs from infected assays were activated. The next step was extraction of total RNA from control and infected samples for sequencing and assembly of the reads accordingly to human reference genome. These results showed good reliability because of the satisfactory human genome coverage obtained with ~23,000,000 reads per sample, and correlation coefficient of ~1 between duplicates, which are strong indications of data quality. A detailed vision of antigen presenting cells biology after initial contacts with T. cruzi could provide new targets for the disease treatment and it will help understanding the differential evolutions of Chagas disease in patients and in resistance and tolerance to parasite.
Description: Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Faculdade de Medicina, Programa de Pós-Graduação em Ciências Médicas, 2016.
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