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Título: Divisão celular do Trypanosoma cruzi : o papel da subunidade TcSCC1 do complexo coesina e das proteínas centrinas
Autor(es): Souza, Agnelo Rodrigues de
Orientador(es): Lima, Beatriz Dolabela de
Assunto: Trypanosoma cruzi
Expressão gênica
Tripanossomatídeos
Data de publicação: 1-Set-2016
Data de defesa: 5-Ago-2016
Referência: SOUZA, Agnelo Rodrigues de. Divisão celular do Trypanosoma cruzi: o papel da subunidade TcSCC1 do complexo coesina e das proteínas centrinas. 2016. 59 f., il. Dissertação (Mestrado em Patologia Molecular)—Universidade de Brasília, Brasília, 2016.
Resumo: Durante o processo de divisão celular os tripanossomatídeos e alguns microrganismos do reino Fungi mantém o núcleo intacto em um processo denominado de mitose fechada. Além disso, os tripanossomatídeos não apresentam condensação da cromatina e ocorre um alongamento do núcleo para acomodar os cromossomos já replicados. Em leveduras e metazoários, a manutenção das cromátides irmãs juntas durante a divisão celular até a sua separação na transição metáfase e anáfase é realizada pelo complexo coesina. Análise dos genomas de tripanossomatídeos mostrou que genes do complexo coesina e de proteínas centrinas estão presentes e são conservados. Para investigar a função da subunidade TcSCC1 do complexo coesina e das cinco proteínas centrinas preditas em T. cruzi, o agente etiológico da doença de Chagas, foram feitas clonagens dos genes TcSCC1 e TcCEN1 a 5. Para a análise de citolocalização dessas proteínas no parasita, os genes TcSCC1, TcCEN2, 4 e 5 foram subclonados no vetor de expressão transiente pRTEGFP que contém o promotor ribossomal, a região 5’UTR do gene para a amastina, o gene para a proteína fluorescente verde (EGFP) e a região 3’UTR do gene TCR27. A subclonagem foi realizada de modo que as proteínas de estudo foram expressas como fusão no N-terminal da EGFP. Esses plasmídeos foram utilizados em transfecção transiente e a expressão da EGFP com e sem as fusões proteicas foram visualizadas por microscopia de fluorescência. As centrinas 2, 4 e 5 e a subunidade TcSCC1 da coesina fusionadas com EGFP apresentaram uma localização predominantemente nuclear, embora não exclusivo, quando comparado com a EGFP sem fusão. Para verificar se as proteínas estudadas são expressas em T. cruzi foram realizadas análises de PCR quantitativa nas suas três formas de vida: amastigotas, epimastigotas e tripomastigotas. Verificamos que todos os genes são expressos na forma de mRNA. As centrinas 2 e 5 apresentaram a maior expressão relativa nas três formas enquanto que as centrinas 1 e 3 apresentaram expressão equivalente à GAPDH em amastigotas e epimastigotas, mas em tripomastigotas uma expressão maior. A centrina 4 apresentou uma expressão relativa muito menor que a GAPDH e às outras centrinas nas três formas do parasita. Deste modo, concluímos que as cinco centrinas e a subunidade SCC1 são expressas em T. cruzi com uma possível localização nuclear. ________________________________________________________________________________________________ ABSTRACT
During cell division the trypanosomatids and some fungi microorganisms keeps the nucleus intact in a so-called closed mitosis. Furthermore, the trypanosomes do not show chromatin condensation and it occurs nucleus elongation to accommodate the replicated chromosomes. In yeast and metazoan, maintenance of sister chromatids together during cell division until their separation in metaphase and anaphase transition is performed by cohesin complex. Analysis of trypanosomatid genomes showed that genes for the cohesin complex and for centrin proteins are present and conserved. To investigate the function of TcSCC1 subunit of cohesin complex and the five predicted centrin proteins in T. cruzi, the causative agent of Chagas disease, cloning of the TcSCC1 gene and all five TcCEN genes was performed. For cytolocalization analysis of these proteins in the parasite, TcSCC1 and TcCEN2, 4 and 5 genes were subcloned into the transient expression vector pRTEGFP that contains the ribosomal promoter, the 5'UTR region of the amastin gene, the gene for green fluorescent protein (EGFP) and the 3'UTR region of the TCR27 gene. Subcloning was performed so that the proteins were expressed as fusion proteins at the N-terminus of EGFP. These plasmids were used in transient transfection and expression of EGFP with and without the protein fusions were visualized by fluorescence microscopy. The centrins 2, 4 and 5 and TcSCC1 cohesin subunit fused to EGFP showed a predominantly nuclear localization, although not unique, when compared to EGFP without fusion. To verify that the studied proteins are expressed in T. cruzi quantitative PCR analysis was performed in its three forms of life: amastigotes, epimastigotes and trypomastigotes. We found that all genes are expressed as mRNA. The centrins 2 and 5 had the highest relative expression in three forms while centrins 1 and 3 had equivalent expression to GAPDH in amastigotes and epimastigotes, but higher expression in trypomastigotes. The centrin 4 showed a much smaller relative expression to GAPDH and the other centrins in the three forms of the parasite. Thus, we conclude that the five centrins and the SCC1 subunit are expressed in T. cruzi with a possible nuclear localization.
Informações adicionais: Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Faculdade de Medicina, Programa de Pós-Graduação em Patologia Molecular, 2016.
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