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Título: Análise proteômica de epimastigotas da cepa G de Trypanosoma cruzi isolada de um gambá da Amazônia
Outros títulos: Proteomic analysis of G strain epimastigotes of Trypanosoma cruzi isolated from an opossum of Amazonic Region
Autor(es): Negreiros, Raquel Silva de
Orientador(es): Santana, Jaime Martins de
Assunto: Chagas, Doença de
Trypanosoma cruzi
Espectrometria de massa
Data de publicação: 7-Mar-2014
Data de defesa: 2013
Referência: NEGREIROS, Raquel Silva de. Análise proteômica de epimastigotas da cepa G de Trypanosoma cruzi isolada de um gambá da Amazônia. 2013. 199 f., il. Tese (Doutorado em Patologia Molecular)—Universidade de Brasília, Brasília, 2013.
Resumo: Diversos isolados e cepas de Trypanosoma cruzi são classificados em seis grupos genéticos ou discrete typing units (DTUs), TcI a TcVI. A cepa G estudada no presente trabalho pertence ao DTU TcI e foi isolada de um gambá da região Amazônica brasileira. Parasitos pertencentes a essa cepa apresentam um genoma não híbrido e menor que da cepa CL Brener. Além disso, tripomastigotas metacíclicas da cepa G são qualificados como pouco virulentas e, surpreendentemente, amastigotas axênicas são altamente infectivas. Dentro de um amplo projeto do nosso grupo de pesquisa que envolve o futuro sequenciamento do genoma da cepa G de T. cruzi, está inserida a análise proteômica de epimastigotas em larga escala que auxiliará na anotação dos genes. Para isso, foi realizada a análise por LC-MS/MS dos peptídeos gerados por digestão em gel do lisado proteico de epimastigotas. Foram feitas três buscas automatizadas em bancos de dados. Para a primeira busca, utilizando-se do banco de dados de Trypanosoma spp. e outros tripanossomatídeos, 1.460 proteínas foram identificadas. Para a segunda busca, no banco de dados apenas da cepa CL Brener, foram obtidas 953 identificações. Para ambas as buscas, foi utilizado o algoritmo do programa Sequest. Já com a utilização do algoritmo do PEAKS, foram detectadas 2.947 proteínas a partir do confronto dos espectros MS/MS com o banco de dados das cepas CL Brener e Sylvio X10/1. Considerando essa última abordagem, este é o proteoma mais abrangente realizado até hoje disponível independentemente do estágio de vida. Em todas as buscas, a via metabólica mais abundante em número de anotações foi metabolismo de purinas, o que está condizente com o alto requerimento energético de formas epimastigotas replicativas. A via glicólise também foi listada entre as dez vias metabólicas mais representativas em todas as buscas, provavelmente devido à presença de glicose no meio de cultivo e à preferência por essa hexose como fonte de carbono por epimastigotas. Todas as buscas resultaram na predominância de proteínas preditas a serem secretadas pela via não clássica e na identificação de diversas proteínas integrais de membrana potenciais, mostrando que a extração de proteínas por solubilização com SDS foi eficiente para o propósito de um proteoma abrangente. Particularmente, na busca 3, foram identificadas várias proteínas candidatas a alvos de drogas estudadas pelo nosso grupo, como leucil-aminopeptidase (LAP), oligopeptidase B (OPB), proliloligopeptidase (POP), metiltioadenosina fosforilase (MTAF) e catepsina B. Em relação às famílias multigênicas de T. cruzi, a terceira busca resultou na identificação de uma grande quantidade de membros das famílias de transsialidases (TS), mucin-associated surface proteins (MASP), mucinas, proteínas retrotransposon hot spot (RHS) e dispersed gene family 1 (DGF-1) e glicoproteínas de 63 kDa (gp63). Portanto, podemos concluir que a busca no banco de dados das cepas CL Brener e Sylvio X10/1 foi a mais satisfatória. Este proteoma representa um avanço significativo para o conhecimento do conjunto de proteínas expresso em T. cruzi e, também, um passo importante para a elucidação da sequência genômica da cepa G de T. cruzi.
Abstract: Many isolates and strains of Trypanosoma cruzi are classified into six genetic groups or DTUs (discrete typing units), TcI to TcVI. G strain studied in the present work belongs to DTU TcI and was isolated from an opossum of Brazilian Amazon. G strain parasites have a non-hybrid and smaller genome than CL Brener strain. Moreover, G strain metacyclic trypomastigotes forms are characterized as low virulent and surprisingly axenic amastigote forms are highly infective. Within a broad project of our research group, which involves the subsequent genome sequencing of T. cruzi G strain, high-throughput proteomic analysis of epimastigotes is inserted to help gene annotation. For this, LC-MS/MS analysis of peptides generated by in-gel digestion of epimastigote protein lysate was accomplished. Three database automated searches were done. The search using the database of Trypanosoma spp. and other trypanosomatids allowed identification of 1.460 proteins. Secondly the search against T. cruzi CL Brener strain database resulted in 953 identifications. For both searches, Sequest algorithm was employed. With the use of PEAKS algorithm, 2.947 were detected from search against both CL Brener and Sylvio X10/1 strains database. Considering the last approach, this is the most abrangent proteome that has been revealed so far regardless the life stage of the parasite. In all searches, the most abundant metabolic pathway in number of annotations was purine metabolism, which is consistent with high energy requirement of replicative epimastigote forms. The glycolysis pathway also was related to the ten most representative metabolic pathways in all searches, probably due to the presence of glucose in culture medium and the preference for this hexose as carbon source by epimastigotes. All searches revealed the predominance of proteins secreted by non classical pathway and in the identification of many potential integral membrane proteins, showing that protein extraction was efficient for the purpose of an in-depth proteome. Notedly, with the search against both CL Brener and Sylvio X10/1 strains database, several drug target candidates studied by our group, as leucyl aminopeptidase (LAP), oligopeptidase B (OPB), prolyl oligopeptidase (POP), methylthioadenosine phosphorylase (MTAF) and cathepsin B were detected. In relation to multigenic families of T. cruzi, the third search resulted in the identification of a large amount of members of families of trans-sialidases (TS), mucin-associated surface proteins (MASP), mucins, retrotransposon hot spot (RHS) and dispersed gene family 1 (DGF- 1) proteins and 63 kDa glycoproteins (gp63). Therefore, we conclude that the search against both CL Brener and Sylvio X10/1 strains of T. cruzi was the most satisfactory. This proteome represent a significant advance in understanding the set of proteins expressed in T. cruzi and also an important step for elucidation of genome sequence of T. cruzi G strain.
Informações adicionais: Tese (doutorado)—Universidade de Brasília, Faculdade de Medicina, Programa de Pós-graduação em Patologia Molecular, 2013.
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