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Please use this identifier to cite or link to this item: http://repositorio.unb.br/handle/10482/10293
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Title: Vitrificação de ovócitos bovinos em diferentes estágios da meiose pelo método de cryotop : avaliação de danos morfológicos, funcionais e moleculares
Other Titles: Vitrification of bovine oocytes at different meiotic stages using Cryotop method: assesmente of morphological molecular and functional damages
Authors: Sprícigo, José Felipe Warmling
Orientador(es):: Dode, Margot Alves Nunes
Assunto:: Bovino - reprodução
Criopreservação de órgãos, tecidos, etc.
Ovócito
Issue Date: 20-Apr-2012
Citation: SPRÍCIGO, José Felipe Warmling. Vitrificação de ovócitos bovinos em diferentes estágios da meiose pelo método de cryotop: avaliação de danos morfológicos, funcionais e moleculares. 2011. xvii, 70 f., il. Dissertação (Mestrado em Ciência Animal)—Universidade de Brasília, 2011.
Abstract: A vitrificaçào com cryotop surgiu como uma opçào promissora para a criopreservaçào de ovócitos, por minimizar efeitos negativos e melhorar as taxas de sobrevivência. O objetivo deste estudo foi avaliar o efeito da vitrificaçào em diferentes momentos da maturação in vitro (MTV), quanto às características morfológieas, funcionais e moleculares, em ovócitos bovinos. Foram utilizados complexos-cumulus-ovócitos (CCOs) obtidos de ovários de abatedouio. Paia os experimentos 1 e 2, os ovócitos foram distribuídos em 4 grupos: controle (GC), não vitrificado; 0 hora vitrificado (VO); S horas vitrificado (VS) e 22 horas vitrificado (V22). Todos os grupos vitrificados foram desvitrifícados e retornaram para a MrV até completar 24 horas. Para a avaliação da cromatina, CCOs foram desnudados, fixados e corados com lacmoide. Para a taxa de fecundação, ovócitos foram submetidos à fecundação in vitro (FIV), e após 18 horas de co-cultivo com os espermatozóides foram fixados e corados com lacmoide. O desenvolvimento embrionário foi avaliado, pelas taxas de clivagem e blastocistos em D2. D7 e D8, após a inseminação (pi). Para análise estatística foi empregado o teste Qui-quadrado (P<0,05). Quanto ao experimento 3. primeiramente foi quantificada a expressão de genes ligados à apoptose (Caspase-3 e P-53) e ao controle epigenético (HDAC 2, Dnmt-1 e SUV39H1) em ovócitos maturados m vitro por : 0 (GCO), 8 (GC E), 22 (GC22) e 24 horas (GC24). Posteriormente, foi avaliado o efeito da vitrificaçào em diferentes momentos da MIV (0, 8 e 22 horas) na expressão desses mesmos genes. Para isso ovócitos de todos os grupos vitrifícados e do controle foram coletados ás 24 horas de MIV. A avaliação da expressão gênica. foi realizada por qPCR e os dados analisados por ANOVA one-way. (P<0,0S). A capacidade do ovócito de atingir Mil, após a maturação, clival e se desenvolver até blastocisto foi superior no grupo controle (P<0,05) comparado aos grupos vitrifícados. não havendo diferenças significativas entre estes (P>0.05). Já a taxa de fecundação, apesar de ser superior no grupo controle (P<0.05) o grupo VO apresentou a menor porcentagem de ovócitos fecundados e maior de ovócitos degenerados (P<0,05). comparado aos demais grupos. Quanto ao perfil de expressão gêmea em ovócitos durante a MIV. foi observado que os níveis de transcritos do gene Caspase-3 estavam aumentados (P<0,05). nos grupos GC22 e GC24. comparados á GCO e GCS, também foi observado um aumento (P<0.05) da expressão do gene Dnmt-1. nos grupos GC8. GC22 e GC24 comparados ao GCO. Entretanto, não foi observada alteração na abundância dos transcritos em nenhum dos grupos submetidos à vitnficação (P>0,0:j), comparados ao CG24. Conclui-se que. apesar dos baixos resultados, a vitnficação pode ser empregada para a conservação de ovócitos bovinos, independente do momento da MIV. Os níveis de transcritos avaliados nào foram alterados em resposta à vitrificaçào. Entretanto, foi constatado um aumento na expressão da Caspase-3 e Dnmt-1, durante a MIV. ______________________________________________________________________________ ABSTRACT
Vitrification by cryorop method has emerged as a promising option for oocytes cryopreservation, by minimizing negative effects and improving survival rates. The aim of this research was to evaluate the effect of vitrification at different tunes point during in vitro maturation (TVM) on functional, morphological and molecular characteristics of bovine oocytes. For all the experiments cumulus-oocytes-complexes (COCs) were obtained from slaughterhouse ovaries. In first and second experiments, oocytes were distributed into 4 groups: control non-vitrified(C&); 0 hour vitrified (VO); 8 hours vitrified (VS) and 22 hours vitrified (V22). In all groups oocytes were vitrified and wanned, and then returned to incubator until 24 hours of IVM. For chromatin evaluation, COCs were denuded, fixed and stained with lacmoid. To evaluate fertilization rates, oocytes, were fixed and stained with lacmoid 18 hours after in vitro insemination (pi). Embryonic development was accessed by cleavage and blastocyst rates at D2. D7 and D8 (pi). Data were analyzed by Chi-square test (P <0.05). A third experiment was designed to evaluated inRNA expression of apoptosis (Caspase-3 and P-53) and epigenetic control related genes (HDAC 2, SUV39H1 and Dnmtl).First gene expression was quantified at different time points during oocyte IVM: 0 (CGO). 8 (CG 8), 22 (CG22) and 24 hours (CG24). Then, the effect of vitrification at different moments of IVM (0, 8 and 22 hours) on genes expression was studies. Gene expression was performed by qPCR and data were analyzed by one-way ANOVA (P <0.05).. The ability of the oocyte to reach Mil after maturation, to cleave and to develop to blastocyst w:as higher in CG (P <0.05), compared to vitrified groups, which did not differ among them (P:: 0.05). For fertilization rates, CG also presented superior results compared to all vitrified groups (P <0 05). However, when vitrified groups were compared. VO had the lowest rate of fertilized oocytes and higher rate degenerated oocytes than the other groups (P <0.05). Gene expression profile in oocytes during IVM, showed that mRNA levels of Caspase-3 were increased (P <0.05) in both CG22 and C&24 compared to CGO and CGE. An increase in Dnnit-1 gene expression was also observed (P <0.05) in CGS, CG22 and CG24 compared to CGO. No difference in mRNA relative abundance was observed in any of the vitnficated group (P> 0.05), compared to CG24. hi conclusion, despite the poor results, vitrification can be used to preserve bovine oocytes , regardless to IVM time. Transcript levels of the studied genes were not affected by vitrification procedure. However, an increase in mRNA levels of Caspase-3 and Dntnt-1 genes was observed during IVM, suggesting transcription processes during this period.
Description: Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Faculdade de Agronomia e Medicina Veterinária, 2011.
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